1、ICS 67.050 X 04 中华人民圭t./、gB 和国国家标准GB/T 23815-2009 猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法Protocol of the polymerase chain reaction for detecting plant components in meat 2009-05-27发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2009-09-01实施发布GB/T 23815-2009 前本标准的附录A为资料性附录。本标准由中国标准化研究院提出并归口.本标准负责起草单位z国家加工食品质量监督检验中心广州、广州市质量监督检测研究院、中华人民共
2、和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人z郭新东、邓鸿铃、罩芳芳、罗海英、袁洁、吴玉盔、谢文缄。I GB/T 23815-2009 猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法1 范围本标准规定了猪肉制品中植物成分的定性PCR检测方法。本标准适用于由猪肉制成的半成品和成品中植物成分的定性检测。本标准的检出限为0.5ng植物DNA.2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不造用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB
3、/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008 , ISO 3696: 1987, MOD) GB/T 19495. 1 转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495. 7 转基因产品检测抽样和制样方法3 术语和定义GB/T 19495. 1确立的术语和定义适用于本标准。4 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。5 抽样和制样按照GB/T19495. 7规定的方法执行。6 测定方法6. 1 原理样品经过提取DNA后，针对植物特异基因的序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩
4、增植物基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有植物成分。6.2 试剂和材料除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。6.2. 1 引物:检测猪肉制品内源和外源基因的引物及其信息见表1。表1猪肉制晶内、外源基因所需的引物信息检测基因引物序列PCR产物大小/基因性质适用范围bp 正:5 -CGAAA TCGGT AGACGCT ACG-3 植物叶绿体猪肉制品tRNALeu 193 反:5 -TTCCA TTG AGTCTCTGCACCT -3 5 -AAGTT AGAGATCGGGAGCCT AA-3 mi tochondrion 264 猪
5、内源线粒体基因猪肉制品5-AAGGTGACAATAGGTAGTCC-3 1 GB/ T 238 15-2009 6.2. 2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.2.7 6.2.8 6.2.9 6.2. 10 6.2. 11 6. 2. 12 6.2. 13 6.2. 14 6.2.15 6.2. 16 6.2.17 6.2. 18 J1J脂糖:屯泳纯aTris饱和酣.三氯可l炕.冰乙酸.无水乙醇.异j立即.异丙醉.组氧化销(:-.IaOH) 盐酸(HCD.三经耶基氨基甲荒(Tr庐乙二胶阿乙酸纳盐(azED了11Fd煎糖.澳酣蓝。为5.26.2. 19 1 X TA 50 T
6、AE (242 g T ris , 57. 1 aOH调节-LH至.O.j1fC按比例黯骨。is O. 01 mol/ L.NazEDTA a.OOl m1/L.用NazEDTA，用H6.2.20 TE缓冲6.2.21 6.2.22 aq酶，dNtp飞lXBuffer，氧化主(Mgl.25%澳酣蓝.()(噩噩黯度窜，曹磊液.6.2.23 漠化乙6.2.24 6. 2.25 6.2.26 6. 3 主要仪器6.3.1 PCR热循环6.3. 2 电泳仪a6.3.3 凝JJ先成像系统。6.3.4 离心机:12000 r/ mi 6.3.5 涡旋振荡器组6. 3.6 分析夭平:0.1 g. 6. 3.
7、 7 微监可调移液器:0.5L，2L，10 JL1川崎凶，6.3. 8 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计，6. 4 检测步骤6.4. 1 模植DNA的提取6. 4. 1. 1 对照阳性对照:猪基因组DNl.、榄树囚组D:A;阴性对!叹:已知以不含眩址i目的样t.r.Wl的D.;s告臼对照:.:又羔水(cldH0) . 6. 4. 1. 2 提取步骤a) 样IDA提取时设双平行:2 JfC200L.I000吟。/ pH至1l.0，G/T 23815- 2009 b) 将悴Ab甜碎，取适量样品放入:1.mL离心智.加入.00I.LL TE缓i巾被.二.20)，于65CJ.浴中溶解10min.上下颠倒
8、混匀;c) 加入与溶液等体积苯酣+三氯甲;皖+异戊醇(2;，+24，1)(6.2.16)，摇晃1昆匀10min; d ) 1.2 000 r/min室温离心10min，将上清液转移豆另一干净的1.;)mL离心管中;的加入上清穰等体积三氯甲皖+异戊醇(24+1)(6.2.17)，摇晃混匀10min; f) 12 000 r介llIn室温离心10min，小心吸取上清液;g) 加入t清液1/10体积乙酸铀溶被(6.2.18)、2倍-2.5倍体积经-20 .C:侦冷的元水乙醇回-(6.2.6).颠倒混匀后一20.C静rnh;或加入夺体县并丙醇(6.2.8)，混匀后室温静置10min; 表2PCR反应体
9、系、比.J试知j名称.以UffTMgCl, dNTP 2.5 mrnol/L Primers 20 pmol/L T aq 5 U/L 丁-Tllplate|0.1川川2g/LddH,O 式中:) n N一一核平行反应同时设置/ 品入/反气体系叫/2. 5 2. 5 2.0 正:0.25反:0.25O. 15 补足反应体系总体积为253 GB/T 23815-2009 6.4.3.2 PCR反应循环参数见表3.表3各基因栓测PCR反应条件基因变性扩增植物叶绿体94 C /30 s 94 C/ 5 n 60 C /30 s tRNALeu基因72 C /30 s 94 C /30 s 猪内源基因
10、94 C/5 n 54 C /30 s 72 C /30 s 6.4.4 PCR扩增产物电泳检测循环数后延伸35 72 C / 5 min 35 72 C /5 min 将适量的琼脂糖(6.2.2)加入1XTAE缓冲液(6.2.19)中，配制成浓度为2%(质量浓度)的溶液，加热溶解，然后加入澳化乙键溶液(6.2.23)至终浓度O.5g/mL，混匀，稍适冷却后，倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固后，放入盛1XTAE缓冲液的电泳槽中，轻轻垂直向上拔去梳板。在每个泳道中加入造量的PCR产物与上样缓冲液(6.2.22)的混合液(10L20LPCR产物与上样缓冲液2L混合)，其中一个泳道中加入DNA分子
11、质量标准品(6.2.26)5L，接通电源电泳，按2V/cm的电压电泳至澳酣蓝迁移至3cm5 cm处结束。凝胶成像仪观察并分析记录。6.4.5 结果分析6.4.5. 1 内酒基国的检测用针对猪内源基因设计的引物对样品DNA提取液进行PCR测试，以猪肉DNA为阳性对照，阳性对照和待测样品均应被扩增出264bp的PCR产物。如未见有该PCR扩增产物，则说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应重新提取DNA，直到扩增出该PCR产物。6.4.5.2 植物基因的检测对样品DNA提取液进行植物特异基因的PCR测试，以植物DNA作为阳性对照，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带
12、，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带(扩增片段大小为193b肘，则可初步判定待测样品中含有可疑的植物成分，应进一步进行确证实验，依据确证实验的结果最终报告d日果待测样品未出现PCR扩增产物，则可断定待测样品中不含有植物成分。6.4.6 确证实验当PCR检测结果为阳性时，可通过实时荧光PCR方法或其他方法(如测序比对，序列参见附录A)进行确证试验;推荐实时荧光PCR探针序列5人GCAATCCTGAGCCAAA TCC-3。7 结果表述7. 1 植物特异基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出植物成分，结果表述为样品中检测出植物成分，阴性对照、阳性对照及空白对照
13、检测结果正常。7.2 猪内源基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而植物特异基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出植物成分，结果表述为样品中未检测出植物成分，阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常。4 ，画-S国 s GB/T 23815-2009 附景A资料性附景扩增片段序列A.1 植物叶锺体tRNALen基因片段(193bp) CGAAATCGGT AGACGCTACG GACTTAATTG GATTGAGCCT TAGTATGGAA ACTCTAAG TGATAACTTT CAAATTCAGA GAAACCCAGG AATTAAAAAT
14、 GGGCAATCCT GAGCCAAATC CTCTTCTCCT TTCCAAGAAC AAACAGGGGT TCAGAAAGCG AAAAAGGGGG ATAGGTGCAG AGACTCAA TG GAA A.2 DbxhondriOD基因片段(264bp) AAGTTAGAGA TCGGGAGCCT AAATCTCCCC TCAATGGTAT GCCACAACTA GATACATCCA CATGATTCAT TACAATTACA TCAATAATTA TAACATTATT TA TTTTA TTC CAACTAAAAA TCTCAAACTA CTCAT ACCCA GCAAGCCCAG AATCAATTGA ACTCAAAACT CAAAAACATA GCACCCCTTG AGAAATAAAA TGAACGAAAA TCTATTTGCC TCTTTTATTG CCCCCACGAT AATAGGACTA CCT A TTGTCA CCTT 5
