1、ICS 65. 120 B 46 中华人民共和国国家标准GB/T 23873-2009 饲料中马杜霉素银的测定Determination of maduramicin ammonium in feeds 2009-05-26发布2009-10心1实施中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局也堂中国国家标准化管理委员会保叩目。吕本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。本标准起草单位:农业部饲料质量监督检验测试中心(济南)。本标准主要起草人:梁萌、汤文利、任爱丽、赵金毅、黄莹、李永山、刘学江。GB/T 23873-2009 I GB/T 238
2、73-2009 饲料中马杜霉素银的测定1 范围本标准规定了测定饲料中马杜霉素镀含量的高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC甲MS)。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。HPLC法为定量测定方法，定量限为1 mg/峙。LC-MS法为定性测定方法，最低检测含量为0.5mg/kg。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实
3、验室用水规格和试验方法GB/T 14699. 1饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3 采样3. 1 采样步骤:按GB/T14699. 1的规定执行。3.2 试样的制备:按GB/T20195的规定执行。4 HPLC法4. 1 原理用乙腊提取饲料中的马杜霉素钱，蒸干提取液用乙腊溶解，用对-二甲氨基苯甲醒溶液进行柱后衍生，HPLC测定。4.2 试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.2.1 水，GB/T6682，一级。4.2.2 甲醇:色谱纯。4.2.3 乙睛:色谱纯。4.2.4 四氢吠喃:色谱纯。4.2.5 磷酸二氢铮:优级纯。4.2.6 磷酸z优级纯。4.2.7 对-二甲氨基苯
4、甲醒:纯度99%0 4.2.8 硫酸z优级纯。4.2.9 磷酸-磷酸二氢饵缓冲溶液(pH3.0):准确称取2.04g磷酸二氢铮(4.2.5)，加900mL水溶解，加磷酸(4.2.6)数滴调节pH至3.0，转移到1000 mL容量瓶中，用水定容、摇匀。4.2.10 流动相:磷酸-磷酸二氢饵缓冲溶液(4.2.9)+四氢吠喃(4.2.4)十甲薛(4.2.2)工100十40十86004.2. 11 对-二甲氨基苯甲醒衍生化溶液z准确称取16g对-二甲氨基苯甲醒(4.2. 7)于1000 mL棕色试剂瓶中，加入400mL甲酶(4.2.2)，在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，逐滴加入8mL硫酸(4.2.的，
5、继续搅拌至溶液均匀，冷却至室温，24h内使用。1 GB/T 23873-2009 4.2.12 马杜霉素镀贮备溶液(1000g/mL) :准确称取107.0mg(精确到0.1mg)马杜霉素镀化学对照品(纯度93.7%)于100mL容量瓶中，用乙腊(4.2.3)溶解、定容，配制成浓度为1000g/mL的贮备溶液。置于4oC ,._, 8 oC冰箱中，有效期为1个月。4.2.13 马杜霉素镀中间溶液1(100g/mL) :准确移取马杜霉素镀贮备溶液(4.2.12)5.00 mL于50 mL容量瓶中，用乙脂定容。置于4oC ,._, 8 oC冰箱中，有效期为1周。4.2.14 马杜霉素续中间溶液II
6、(1 0. 0g/mL) :准确移取马杜霉素钱中间溶液1(4.2.13)5.00 mL于50 mL容量瓶中，用乙腊定容。置于4oC ,._, 8 oC冰箱中，有效期为1周。4.2.15 马杜霉素续工作溶液:准确移取马杜霉素镜中间溶液II(4.2.14) 1. 00 mL、5.00mL于10mL 容量瓶中，马杜霉素镀中间溶液11. 00 mL、5.00mL于10mL容量瓶中，马杜霉素镀贮备溶液1. 00 mL、2.00mL、3.00mL于10mL容量瓶中，用乙腊稀释、定容，配制成浓度分别为1.00g/mL、5.00g/mL、10.0g/mL、50.0g/mL、100g/mL、200g/mL、30
7、0问/mL的工作溶液。现用现配。4.3 仪器4.3.1 实验室用样品粉碎机。4.3.2 分析天平:感量0.1mgo 4.3.3 腆量瓶:150 mLo 4.3.4 超声波清洗器。4.3.5 往复式振荡器。4.3.6 带盖塑料离心管:100 mLo 4.3.7 离心机。4.3.8 旋转蒸发仪:配置150mL鸡心瓶。4.3.9 旋涡混合器。4.3.10 高效液相色谱仪:具紫外检测器或二极管阵列检测器。4.3. 11 柱后衍生系统。4.4 分析步骤4.4.1 提取称取约5g试样(精确到0.1mg)于腆量瓶(4.3.3)中，加入乙腊50mL，置于超声波清洗器(4.3.4)中超声15min，然后置于往复
8、式振荡器(4.3.5)中快速振荡提取20mino转移到离心管(4.3.6)中，用适量乙腊清洗腆量瓶三次，清洗液合并到离心管中。置离心机(4.3.7)4 360g离心3min;上清液转移到鸡心瓶(4.3.8)中，在旋转蒸发仪上600C浓缩定容至5.00mL，旋涡(4.3.9)混匀，分取适量提取液过有机滤膜上机测定。根据试料溶液中马杜霉素续的浓度用乙脂进行稀释，使其上机浓度不高于300g/mLo 4.4.2 测定4.4.2.1 液相色谱测定参数的设定色谱柱:C18柱，柱长150mm，内径2.1mm，粒度5m或类似的分析柱。柱温:25oC。检测波长:585nm。进样量:25L。流动相z磷酸-磷酸二氢
9、饵缓冲溶液(pH3.0)+四氢吠喃十甲醇=100十40+860(4.2.10)。流速:0.4mL/mino 4.4.2.2 柱后衍生系统测定参数的设定2 衍生化溶液:对-二甲氨基苯甲酶衍生化溶液(4.2.11)。衍生化溶液流速:0.5mL/min。反应器容积:1.00 mL。G/T 23873-2009 反应器温度:900C。4.4.2.3 定量测定在上述仪器条件下，分别注入马杜霉素镀工作溶液(4.2.1日和试料溶液(4.4.1)进行测定。用工作溶液做单点校准或多点校准，以色谱峰的峰面积进行定量计算。4.5 结果计算饲料中马杜霉素续的含量X以质量分数表示，单位为毫克每千克(mg/kg)，按式(
10、1)计算:x=生兰主. . . . . . . ( 1 ) m 式中:A一一试料溶液中马杜霉素镀峰面积的响应值对应的浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V一一试料溶液的体积，单位为毫升(mL); m一一一试料的质量，单位为克(g)。每个试样取两份试料进行平行测定，以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，保留三位有效数字。4.6 重复性在重复性条件下完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于10%。5 LC-MS法5. 1 原理用乙腊提取饲料中的马杜霉素馁，提取液蒸干后用乙脂溶解，用LC-MS测定。5.2 试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.2. 1 水，GB/T6682，一级。5.2
11、.2 乙睛:色谱纯。5.2.3 流动相:乙腊(5.2.2)+水(5.2.1)=90十10。超声脱气5mino 5.2.4 其他同4.2. 12 ,., 4. 2. 15 0 5.3 仪器5.3.1 液相色谱一质谱仪。5.3.2 其他同4.3.1，.，4.3.9。5.4 分析步骤5.4.1 提取同4.4.1，但需要根据试料溶液中马杜霉素钱的含量用乙腊进行稀释，使上机溶液浓度不高于50g/mL。5.4.2 测定5.4.2.1 液相色谱测定参数的设定色谱柱:C18柱，柱长150mm，内径2.1mm，粒度5m或类似的分析柱。进样量:5Lo流速:0.2mL/mino 柱温:300C。流动相:乙腊+水=9
12、0+10(5.2.3)。5.4.2.2 质谱测定参数的设定离子化模式:电喷雾离子源，负离子模式(ESI一。雾化气压力:2. 76 X 105 Pa(40. 0 psi)。干燥气流速:9.0L/min。干燥气温度:350 oC。毛细管出口电压:一3500 Vo碰撞气=氮气。离子电荷控制3 GB/T 23873-2009 (ICC) :on。扫描范围:100 m/z 1 200 m/zo化合物稳定性:30%。质谱振幅:1. 00 V。开始振幅:30%。结束振幅:100%。定性离子:母离子(m/z):915，子离子(m/z):613 ,871 0 5.4.2.3 定性测定在相同试验条件下，利用质谱定
13、性离子定性。样品与标准溶液中马杜霉素钱的保留时间偏差应在土2.5%之内;样品与浓度相近的标准溶液中马杜霉素钱的质谱定性离子进行比较，子离子匹配度在700 ., 1 000之间(或者子离子相对丰度的偏差在表1规定的范围内则判定样品中存在马杜霉素馁。表1定性确证时子离子相对丰度的允许偏差子离子相对丰度/%50 2050 1020 10 偏差/%土20士25士30士504 GB/T 23873-2009 附录(资料性附录)马杜霉素镣谱图A 马杜霉素镀色谱图(HPLC法)见图A.lA.l NdyN由【mAU 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 自un18 16 14 12 10 。马
14、杜霉素银色谱图(1.00g/mL，HPLC法)图A.11034.0 915.6 马杜霉素银质谱图见图A.2分子量:934.17 结构式zIntens XI06 4 3 A.2 2 872.5 619.0652.9 250.0 。XI05 1. 50 613.3 871. 5 1. 25 1. 00 839.4 0.75 0.50 0.25 mlz 1 000 800 600 400 200 0.00 5 马杜霉素镀(MaduramicinAmmonium)质谱图图A.2gONlR的NH筒。国华人民共和国家标准饲料中马杜霉素钱的测定GB/T 23873-2009 中争导中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数10千字2009年8月第一次印刷开本880X12301/16 2009年8月第一版骨定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-38461 GB/T 23873-2009 打印日期:2009年10月14日
