1、ICS 65. 120 B 46 中华人民共和国国家标准GB/T 23881-2009 饲用纤维素酶活性的测定滤纸法2009-05-26发布Determination of feed cellulase activity一Filter paper assay method 中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2009-10-01实施发布U I=l 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(武汉)。本标准主要起草人:何风琴、杨林、钱坊、刘小敏、屈利文、黄婷、颜克亮。GB/T 23881-2009 I 范围饲用纤维素酶活性的
2、测定滤纸法本标准规定了以滤纸为底物，用还原糖比色法测定饲用纤维素酶活性的方法。本标准适用于饲用纤维素酶活性的测定，定量检测限为0.02U/mLo 2 规范性引用文件GB/T 23881-2009 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验用水规格和试验方法GB/T 14699. 1饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3 术语和定义下列术语和定义适用于
3、本标准。3. 1 滤纸纤维素酶活性单位filter paper cellulase activity unit 在37oC ,pH5. 5，反应60min的条件下，每分钟降解滤纸释放1mol葡萄糖所需的酶量，定义为一个滤纸纤维素酶活性单位，以U表示。4 原理纤维素酶水解滤纸产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大吸收，在一定范围内酶解产生的还原糖的量与反应液的吸光值成正比。5 试剂和材料本标准使用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。5. 1 酒石酸饵铀(C4H4KNa06 4H20)。5.2
4、 苯盼。5.3 亚硫酸锅。5.4 氢氧化铀溶液(200g/L):称取氢氧化销20.0g，加100mL水溶解。5.5 拧橡酸溶液(0.1 mol/L):称取拧橡酸(C6H807 H20)2.10 g，加水溶解定容至100mL。5.6 拧棱酸纳溶液(0.1 mol/L):称取拧棱酸锅(Na3C6Hs07 2H2 0)2. 94 g，加水溶解定容至100 mL D 5. 7 拧橡酸盐缓冲液(0.05 mol/， pH5. 5) :称取拧棱酸(CSH807 H 2 0)10. 5 g，加入氢氧化锦5.0g , 再加800mL水溶解，用拧棱酸溶液(5.5)或拧橡酸锅溶液(5.的调节pH至5.5，再用水定
5、容至1 000 mL。GB/T 23881-2009 5.8 Whatman 1号滤纸条(1.0 cmX 6.0 cm)。5.9 DNS试剂:称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL搅拌溶解，水浴至45OC，然后逐步加入氢氧化锅溶液(5.4)100 mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加入酒石酸饵纳(5.1)91.0 g、苯盼(5.2)2.50 g和亚硫酸纳(5.3)2.50g，搅拌至溶解，冷却到室温后，定容至1000 mL。过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月。警告:处理酸碱和配制DNS试剂肘，应在通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护眼
6、镜和乳胶手套，-8皮肤或眼睛接触了上述物质，及时用大量的水冲洗。5. 10 葡萄糖标准溶液(10.0mg/mL):称取经1050C烘至恒量的元水葡萄糖约1g，精确至0.0001g , 加拧棱酸盐缓冲溶液(5.7)溶解，定容至100mL。6 仪器与设备除常用实验室设备外，其他仪器设备如下。6. 1 分样筛:孔径为0.25mm(60目)。6.2 分析天平:感量为0.0001 go 6.3 pH计:精确至0.0106.4 磁力搅拌器:附加热功能。6.5 电磁振荡器。6.6 离心机。6. 7 侄温水浴锅。6.8 秒表。6.9 分光光度计。6.10 移液器z精度为1L。7 试样的制备按GB/T14699
7、. 1采样，按GB/T20195选取样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，通过0.25 mm孔筛，混匀密闭容器中，低温保存。8 测定8. 1 试样溶液的准备称取0.2g,._, 4 g试样，精确至0.0001 g，加入40mL拧棱酸盐缓冲液(5.7) ，磁力搅拌30min，再用拧棱酸盐缓冲液(5.7)定容至100mL，在4oC条件下避光保存24ho摇匀，取30mL，._，50mL，以3 000 r/min离心3mino取5.00mL上清液，用拧橡酸盐缓冲液(5.7)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活性应控制在0.04U/mL,._, O. 18 U/mL之间。液体样品可以直接用拧
8、攘酸盐缓冲液(5.7)进行稀释，定容(稀释后的酶液中纤维素酶活性应控制在0.04U/mL-0.18 U/mL之间)。如果稀释后的酶液pH偏离5.5，需重新调节pH为5.5，用拧橡酸盐缓冲液(5.7)稀释定容。8.2 标准曲线B.2. 1 分别量取葡萄糖标准溶液(5.10)0. 00 mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00 mL，分别用拧橡酸盐缓冲溶液(5.7)定容至50mL，配成浓度为0.00mg/mL_2. 00 mg/mL的葡萄糖标准系列。8.2.2 分别吸取葡萄糖标准溶液(8.2.1)各1.00 mL于25mL容量瓶中，各加2.00mL水和
9、2.00mL DNS试剂。.9)，沸水浴5mino冷却至室温，用水定容至25mL，在540nm波长下比色，以吸光度作横坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标，列出直线回归方程。GB/T 23881-2009 8.3 酶活性的测定8.3.1 吸取10.0mL经过适当稀释的酶液(8.1)，37oc平衡10min。8.3.2 在25mL具塞比色管中加入滤纸条(5.8)一一一滤纸条须对称剪成32片并全部放人，加1.0 mL 拧棱酸盐缓冲液(5.7)浸润滤纸片，37oc水浴平衡10min，再依次加入2.00mL DNS试剂(5.9) , 0.50 mL酶液(8.3. 1) , 5 mL 水，电磁振
10、荡3s,., 5 s, 37 oc水浴中保温60min(用秒表控制)，然后在沸水浴中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25mL，在540nm波长处测定校准值Ao。8.3.3 在25mL具塞比色管中加人滤纸条(5.8)一一一滤纸条须对称剪成32片并全部放人，加1.0 mL 拧橡酸盐缓冲液(5.7)浸润滤纸片，370C水浴平衡10min，再依次加入0.50mL酶液(8.3.1), 5 mL水，电磁振荡3s ,., 5 s , 37 oC水浴中保温60min(用秒表控制)，加2.00mL DNS试剂(5.的，然后在沸水浴中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25mL。在540nm波长处测定吸光度A
11、109 结果计算9. 1 试样中滤纸纤维素酶活性以X表示，单位为酶活性单位每克(U/g)，按式(1)计算:式(1)中zx = .!. X 1 000 X n MXt X一一试样纤维素酶的活性，单位为酶活性单位每克(U/g); m一一一根据标准曲线方程上计算得的(A1-Ao)值对应的葡萄糖的质量，单位为毫克(mg); M一一一葡萄糖的摩尔质量，180.2g/mol; t一一酶解反应时间，单位为分钟(min); 1000-一转化因子，1mmol= 1 000mol; n一一试样的总稀释倍数。9.2 每个试样取两份试料进行平行试验，测定结果用其算术平均值表示，保留3位有效数字。10 重复性在重复性条
12、件下的两次测定，所得结果的相对偏差不超过20%。. ( 1 ) gONlF的NH闰。国华人民共和国家标准饲用纤维素酶活性的测定滤纸法GB/T 23881-2009 中非中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销骨印张0.5字数7千字2009年8月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2009年8月第一版* 定价14.00元书号:155066 1-38469 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 23881 2009 打印日期:2009年10月14日
