1、 ICS 65.020.20 B 05 DB41 河南省地方标准 DB 41/T 16152018 食用菌菌丝纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋 白酶活力检测技术规程 2018 - 06 - 19 发布 2018 - 09 - 19 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 16152018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由河南省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所。 本标准主要起草人：孔维丽、康源春、袁瑞奇、孔维威、张玉亭、胡素娟、刘芹。 本标准参加起草人：段亚魁、宋志波、徐柯、崔筱、孟庆涛、韩玉娥。 DB4
2、1/T 16152018 1 食用菌菌丝纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、 蛋白酶活力检测技术规程 1 范围 本标准规定了检测食用菌菌丝羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力的方法。 本标准适用于食用菌菌丝培养过程中羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6012016 化学试剂 标准滴定溶液的制备 GB/T 6682 2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 9721 2006 化
3、学试剂 分子吸收分光光度法通则(紫外和可见光部分) GB/T 127282006 食用菌术语 GBT 238742009 饲料添加剂 木聚糖酶活力的测定 GB/T 287152012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法 NY/T 9122004 饲料添加剂 纤维素酶活力的测定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 羧甲基纤维素酶（CMC）活力单位 在 37 ，pH 值为 5.5，每分钟从浓度为 0.8%的羧甲基纤维素钠溶液中水解产生 1 mmol 葡萄糖所 需要的酶量为 1 个酶活力单位（U）。 3.2 木聚糖酶活力单位 在 37 ，pH 值为 5.5，每分钟从浓
4、度 5 mg/mL 的木聚糖溶液中水解产生 1 mol 葡萄糖所需要的 酶量为 1 个酶活单位（U）。 3.3 蛋白酶活力单位 在 40 ，相应 pH 值（中性蛋白酶 pH值=7.5，酸性蛋白酶 pH值=3，碱性蛋白酶 pH 值=13）1 min 水解酪素产生 1 g 酪氨酸所需要的酶量为 1个酶活力单位（U）。 3.4 漆酶活力单位 在室温（25 30 ），pH 值为 5（0.0 8 mol/L 醋酸钠缓冲液）条件下，每秒钟氧化 1 mmol 的 0.5 mmol/L 2,2- 联氮- 双-3- 乙基苯并噻唑- 6- 磺酸（ABTS），所需的酶量为 1 个酶活力单位（U）. 4 仪器与设备
5、DB41/T 16152018 2 分光光度计，波长 350 nm800 nm; pH 计:精度为 0.01 pH 单位; 分析天平：精确至 0.0001 g 和0.01 g; 数显恒温水浴锅:精度为 0.1 ； 磁力搅拌器：温度范围 5 200 ； 移液器：500L1000L； 冰箱：0 20 . 5 试剂与溶液 5.1 试剂与水 所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 5.2 羧甲基纤维素酶（CMC）测定试剂与溶液 按NY/T 9122004中5.1、5.2、 5.3、5.4、5.4、5.6、5.7的规定配制。 5.3 木聚糖酶测定试剂与溶液 按 GBT 238742009中 4.1、4.2、4
6、.3、4.4、4.5、4.6、4.7的规定配制。 5.4 蛋白酶测定试剂与溶液 5.4.1 碳酸钠溶液(Na2CO3)0.4 mol/L 称取无水碳酸钠(Na 2CO3)42.4 g，用水溶解并定容至 1000 mL。 5.4.2 三氯乙酸(CCI3 COOH)0.4 mol/L 称取三氯乙酸 65.4 g，用水溶解并定容至 1000 mL。 5.4.3 氢氧化钠溶液 (N aOH)0.5 mol/L 按 GB/T 6012016 的规定配制。 5.4.4 盐酸溶液(HCl)1 mol/L 及 0.1 mol/L 按 GB/T 6012016 的规定制备配制。 5.4.5 磷酸缓冲液 称取磷酸
7、氢二钠(Na 2HP0412H 20)6.02 g 和磷酸二氢钠(NaH 2PO42H 20)0.50 g，加水溶解并定容至 1000 mL，用pH 计校正至pH=7.50。 5.4.6 乳酸缓冲液 甲液:称取乳酸(80%90%)10.60 g，加水溶解并定容至 1000 mL。 乙液:称取乳酸钠(70%)16.0 g，加水溶解并定容至 1000 mL。使用溶液取甲液 8 mL，加乙液 1 mL, 混匀，稀释一倍，即成 0.05 mol/L 乳酸缓冲溶液，用 pH 计校正至 pH=3.00。 5.4.7 硼酸缓冲溶液 DB41/T 16152018 3 甲液:称取硼酸钠(硼砂)19.08 g，
8、加水溶解并定容至 1000 mL。 乙液:称取氢氧化钠 4.00 g，加水溶解并定容至 1000 mL。 取甲液 500 mL、乙液400 mL 混匀，用水稀释至 1 000 mL，用pH计校正至 pH=10.5。 5.4.8 l0 g/L 酪素溶液 称取酪素 1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L 氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸 2 3 滴)湿润后，加人适量的各种适宜 pH 的缓冲溶液约 80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解， 冷却后，转入 100 mL 容量瓶中，用适宜的 pH 缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三 天。 5.4.9
9、l00 g/mL L-酪氨酸标准溶液 称取预先于 105 干燥至恒重的 L-酪氨酸 0.1000 g，精确至 0.0002 g，用1 mol/L 盐酸60 mL 溶解后定容至 100 mL，即为 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液。吸取 1mg/mL 酪氨酸标准溶液 10.00 mL，用 0.l mol/L 盐酸定容至 100mL，即得到 100 g/mL 的 L-酪氨酸标准溶液。 5.5 漆酶测定试剂与溶液 5.5.1 乙酸溶液（1 mol/L） 冰乙酸0.6 mL，加水溶解，定容至100 mL。 5.5.2 乙酸钠溶液（1 mol/L） 称取无水乙酸钠 82.0g，加水溶解，定容至1000 m
10、L。 5.5.3 乙酸-乙酸钠缓冲液 称取无水乙酸钠8.2 g，加入冰乙酸0.85 mL ，加水溶解，定容至1000 mL。用乙酸溶液或乙酸钠溶 液调节pH=5。 5.5.4 0.5 mmol/L ABTS 溶液 称取0.27 20 g ABTS 试剂 ，加水溶解，定容至 100 mL，随用随配。 6 绘制标准曲线 6.1 CMC 活力标准曲线 按NY/T 9122004 中第7章的规定绘制标准曲线。 6.2 木聚糖酶活力标准曲线 按GBT 238742009 中第6条的规定绘制标准曲线。 6.3 蛋白酶活力标准曲线 按照表1配制不同浓度的 L-络氨酸标准溶液，以标准空白样为对照调零，于 27
11、5 nm 处测定其吸光 度值 A，以L-络氨酸浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线或。根据作图或回归方程计算 出当吸光度为 1 时络氨酸的 量（ g），即为 吸光常数 K（K值应在 130135）。 DB41/T 16152018 4 表1 检测方法及步骤 管号 取100 ug/mL络氨酸标准溶液体积/mL 水体积/mL 络氨酸标准溶液浓度/(ug/mL） 0 0 10 0 1 1 9 10 2 2 8 20 3 3 7 30 4 4 6 40 5 5 5 50 6.4 漆酶活力标准曲线 按照表2配制不同浓度的ABTS标准溶液浓度，以空 白标准样为对照调零，于波长420 nm处测定其
12、吸 光度值，以ABTS溶液浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 表2 ABTS 溶液标准溶液的配制 管号 ABTS试剂重量/mg 水体积/mL ABTS标准溶液浓度/(mmol/L) 0 0 100 0.0 1 5.4868 100 0.1 2 10.9736 100 0.2 3 16.4604 100 0.3 4 21.947 100 0.4 5 27.434 100 0.5 6 32.9208 100 0.6 7 酶活力的测试 7.1 样品的制备 液体培养液采用 2层纱布过滤取上清液，得到待测酶液。固体原料粉碎，称量50 g，加5倍重量去离 子水于三角瓶内，重复3份，25 浸提
13、3 h，间隔1 h振荡，2层纱布过滤取上清液，得到待测酶液。 7.2 CMC 活力的测定 7.2.1 酶液的稀释 待测培养液用缓冲液稀释1025倍，测定的OD值为0.50.6为宜。 7.2.2 测定步骤 按 NY/T 9122004 中第9 章操作。 7.3 木聚糖酶活力的测定 7.3.1 酶液的稀释 DB41/T 16152018 5 按7.2.1的规定操作。 7.3.2 测定步骤 按GB/T 238742009 中第8章的规定操作 。 7.4 蛋白酶活性的测定 7.4.1 酶液的稀释 待测培养液用缓冲液稀释1050倍，测定的OD值介于0.50.6为宜。 7.4.2 测定步骤 取3支具塞试管
14、，一支为空白管，两支为样品管，按表3的测定方法及步骤操作，反应结束后，在分 光光度计波长275 nm处，分别测定样品空白管和样品管中酶液的吸光度值（A 0、 A）。 表3 测定方法及步骤 序号 反应步骤 样品管 空白管 1 加入待测酶液 1.0 mL 1.0 mL（水） 2 预热2 min 3 反应底物预热3 min 4 加入底物溶液 1.0 mL 1.0 mL 5 混匀 6 40反应10 min 7 加入三氯乙酸终止液 2.0 mL 2.0 mL 8 混匀 9 静止10 min 10 过滤 总体积 4.0 mL 4.0 mL 注： 表中表示此步骤需要进行。 7.4.3 结果计算与表示 样品中
15、蛋白酶活力以U表示，按式1计算： U=（A-A 0）K4/10NT （1） 式中： U蛋白酶活力，酶活单位（U/g）或（U/mL）； A 为吸光度值； K为吸光常数，当吸光度值为1时的酪氨酸的量=103.8； 4反应体积，单位mL; N稀释倍数； 10反应时间，单位mim T换算系数，中性、碱性蛋白酶与福林 法的转换系数0.5，酸性蛋白酶系数0.77。 7.5 漆酶活力的测定 7.5.1 酶液的稀释 DB41/T 16152018 6 待测培养液用缓冲液稀释1050倍，测定的OD值在0.50.6之间为宜。 7.5.2 测定步骤 取3支具塞试管，一支为空白管，两支为样品管，按表4的测定方法及步骤
16、操作，反应结束后，在分 光光度计波长420 nm处，分别测定样品空白管和样品管中酶液的吸光度值（A 0、 A）。 表4 测定方法及步骤 序号 反应顺序 样品管 空白管 1 加入待测酶液 0.1 mL 0.1 ml（水） 2 加入缓冲液 1.7 mL 1.7 mL 3 加入底物溶液 0.2 mL 0.2 mL 4 反应时间 6.0 min 6.0 min 5 加入三氯乙酸 0.5 mL 0.5 mL 总体积 2.5 mL 2.5 mL 7.5.3 结果计算与表示 样品中漆酶活力以U表示，按式2计算： U=（A-A 0）/MT1000D60 （2） 式中： U漆酶活力单位， 酶活单位（ U/g）或（ U/mL） ； A粗酶液的吸光度值； 1000mmol 与 umol 的换算系数，1 mmol=1000 umol； D稀释倍数； MABTS分子量，M=548.68； T反应时间，单位 min； 60换算系数，1 min=60 s。 _
