1、ICS 65.020.30 B 41 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 28630.5-2012 自斑综合征(WSD)诊断规程第5部分:新鲜组织的T-E染色法2012-07-31发布Diagnostic protocols for white spot disease Part 5: T-E staining method with fresh tissue 中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2012-11-01实施发布GB/T 28630.5-2012 前言GB/T 28630(白斑综合征(WSD)诊断规程分为五个部分:一二第1部分z核酸探针斑点杂交检测法;第2
2、部分z套式PCR检测法;二一第3部分:原位杂交检测法;一一第4部分:组织病理学诊断法;二二-第5部分z新鲜组织的T-E染色法。本部分为GB/T28630的第5部分。本部分按照GB/T1.1二2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本部分起草单位z中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。本部分主要起草人:黄佳、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。I G/T 28630.5-2012 1 范围自斑综合征(WSD)诊断规程第5部分:新鲜组织的T-E染色法GB/T 28630的本部分规定了
3、白斑综合征新鲜组织的T-E染色法所需试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于在现场或诊断实验室对患病濒死的对虾仔虾、幼虾或成虾进行快速诊断，不适用于对潜伏性感染或病毒的非感染性携带的标本进行诊断。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有修改单适用于本文件。GB/T 28630.4-2012 白斑综合征CWSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法3 原理3. 1 白斑综合征的病原和病理学特征见GB/T28630.4二2012的2.1.3.2 技术原理台盼蓝含有一个弱碱性基团和
4、一个强酸性基团，其弱碱性基团可与核酸相结合，而强酸性基团的存在，使台盼蓝与弱酸性染料伊红互混而不发生沉淀。这样，台盼蓝与伊红的混合液就能一次性地使新鲜组织的细胞核染上蓝色，又能将细胞质染上红色。4 试剂和材料4.1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸锢水或去离子水或相当纯度的水。4.2 T-E染色液:见附录A的规定。5 仪器设备5. 1 解剖刀。5.2 尖头慑子。5.3 医用剪刀。5.4 载玻片。5.5 盖玻片。5.6 光学显微镜:带高倍镜C40X)和油镜(100X)。1 GB/T 28630.5-2012 5. 7 吸水纸。5.8 滴管。6 操作步骤6. 1 样品采集的要求见
5、GB/T28630.4-2012中附录B的规定。6.2 仔虾及体长小于3cm的幼虾，取其头胸部，在载玻片上用解剖刀切碎;体长大于3cm的幼虾及成虾，揭开头胸甲，以尖头慑子取出对虾胃，置于载玻片上，用解剖刀轻轻刮下其上皮等组织。6.3 在组织浆上滴加2滴下E染色液，混匀，常温放置染色3min5 min。6.4 盖上盖玻片，覆上数层吸水纸，轻压以吸去多余染液，除去吸水纸，镜下观察。7 结果要IJ定7.1 正常的对虾组织细胞经T-E染色后，可观察到细胞质为红色，细胞核质为淡蓝色，染色质为深蓝色，核仁为深蓝色或蓝紫色。7.2 白斑综合征病毒(WSSV)感染发病的濒死对虾细胞核可观察到空泡化形态，空泡化
6、是由于细胞核肿大，核仁消失，染色质边移，核内出现病毒发生基质或包涵体(inclusion)所致。其形态表现为细胞核周圈染色发蓝而核内蓝色消退，并不同程度地偏红，看上去呈一个蓝色的环。有些空泡偏离核的中心，使核的形态呈一戒指状。空泡化的细胞核多呈球形，所占比例与对虾发病严重程度有关，在濒死对虾中，可观察到60%以上的上皮组织、结缔组织细胞核出现空泡化，在空胃而行为较活泼的病虾中，这种形态的细胞核约占这些组织细胞核的5%以下。在有些发病急、病情重的对虾中，可观察到细胞核严重膨大，核周圈蓝色变窄变淡，而核内着色鲜红。7.3 在多个视野观察到大量典型的受感染细胞核可作为确诊的依据，诊断结果可疑时，补充
7、组织病理学诊断、核酸探针斑点杂交检测或套式PCR检测进行结果确认。2 A.1 T-E染色擅台盼蓝伊红YC水洛性)苯酣氧化铀甘抽水室温贮存。附录A(规范性附录试剂配方0.6 g 0.2 g 0.5 g 0.5 g 20 mL 80 mL G/T 28630.5-2012 N-ON|.0的NH阁。华人民共和国家标准自斑综合征(WSD)诊断规疆第5部分z新鲜组织的T-E染色法GB/T 28630. 5-2012 国中峰中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张O.5 字数5千字2012年11月第一版2012年11月第一次印刷峰书号:155066 1-45624定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28630.5-2012 打印日期:2012年12月18日F008AOO
