1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1687-2005 马流感血凝抑制试验操作规程Protocol of haemagglutination inhibition test for equine influenza 2005-09-30发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局060509000053 目。E本标准参考了。IE陆生动物诊断试验和疫苗标准手册)2004版。本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人:张利峰、张鹤晓、刘继红、谷强。本标准系首次发布
2、的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1687-2005 SN/T 1687-2005 马流感血凝抑制试验操作规程1 范围本标准规定了马流感血凝抑制试验方法。本标准适用于马流感病毒(H)亚型的鉴定，及其由马流感病毒引起的马流感的诊断、流行病学调查、检疫和监测。2 缩略语下列缩略语造用于本标准。2. 1 HA 血凝试验2.2 HI 血凝抑制试验2.3 PBS 磷酸盐缓冲液2.4 RBC 红细胞3 材料准备3. 1 器材V型96孔微量滴定板、微量移液器、采血管、微量混合器、离心机。3.2 抗原马流感病毒亚型1(H7N7)和马流感病毒亚型2(H3N的，由国家有关主管部门认可的或指定的供应商提供，处理方
3、法见第A.3章。3.3 鸡红细胞鸡红细胞的准备见第A.4章。3.4 血清3.4. 1 标准阳性血清由国家有关主管部门认可的或指定的供应商提供。3.4.2 被检血清采集及前处理在马颈部上三分之一处静脉采血10mL.分离血清并处理后用于检测，马血清前处理方法见第A.5章，若需较长时间检测，可置于40C或一200C。4 操作方法4. 1 微量血凝试验(HA)4. 1. 1 取干净的V型96孔微量滴定板一块，按表l进行操作:每孔加25LPBS液lil1加入前处理过的马流感病毒抗原25L.用微量移液器反复吹打混匀;吸出25L于孔2.吹打棍匀后吸出25L于孔3.如此依次按1: 2倍比稀释到孔11.第11孔
4、弃去25L.最后1孔不加抗原作对照。4.1.2 抗原稀释完后，每孔补加PBS25L。孔12不加抗原，只加PBS液做空白对照。4. 1. 3 每孔加入50L1%鸡红细胞悬液，轻轻振荡棍匀，在适宜温度220C左右静置作用30min. HA SN/T 1687-2005 滴度为红细胞出现凝集的最高稀释倍数。抗原血凝滴度的测定应设置4个重复，取其中位值。表1马流感血凝试验单位为微升孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 抗原稀薄度1 : 2 1 : 4 1 : 8 1 : 16 1 : 32 1 : 64 1 : 128 1 : 256 1 : 512 1 : 1 024 1 : ?
5、, 048 对照PBS液25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 抗原25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1%红细胞50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 在适宜温度22C左右静置作用30min 判定举例|十|十1+1+ I + I + I + I - I I - _ ! 注:马流感抗原的血凝滴度为红细胞出现凝集的最高稀释倍数。因此，能使红细胞出现凝集的最高稀释倍数的病毒液25L称为1个血凝单位(HA)。如某马流感抗原的血凝滴度是1: 128，那么1: 128稀释的该病毒抗原25L即为1个HA单位。在进
6、行马流感血凝抑制试验时，病毒抗原的工作浓度应为4个HA单位。如果该病毒抗原的工作浓度为1: 32，那么25L1 : 32的稀释抗原含有4个HA单位。4.2 血凝抑制试瞌(81)4.2. 1 取于净的96孔微量滴定板一块，按表2进行操作:每孔加25LPBS。4.2.2 孔1加待检血清25L，用微量移液器反复吹打棍匀;吸出25L于孔2，吹打混匀后吸出25L于孔3，如此依次稀释到孔10。孔10t昆匀后吸出25，uL弃掉。最后2孔不加血清，分别做抗原对照和不加血清的空白血凝对照。4.2.3 稀释抗原，含量为4个HA单位(4X最小凝集量，即滴度/4)。4.2.4 每孔中加25L抗原，充分振荡后，在适宜温
7、度220C左右静置作用30min。4.2.5 每孔加50L1%鸡红细胞液，充分振荡后，在适宜温度220C左右静置作用30mino 4.2.6 将滴定板倾斜700判读结果。表2马流感血凝抑制试验单位为微升孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 血清稀释度1 : 2 1 : 4 1 : 8 1 : 16 1 : 32 1 : 64 1 : 128 1 : 256 1 : 512 抗原空白1 : 1 024 对照对照|PBS液25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 75 待检血清25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 4HA抗原25 2
8、5 25 25 25 25 25 25 25 25 25 在适宜温度22C左右静置作用30min 1%红细胞50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 在适宜温度22l.左右静置作用30min 判定举例十十十十十十4.2.7 马流感病毒感染或免疫的马血清能抑制马流感病毒对红细胞的凝集作用。凡能使4个HA单位的抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价(如表2的血凝抑制价为1: 32)。SN/T 1687-2005 5 判定标准5. 1 判定时应首先观察各对照孔是否成立。5.2 红细胞凝集z红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔
9、底，判为血凝作用为阳性十。5.3 元凝集或凝集抑制z红细胞集中于孔底中央呈点状，将9伺6孔微量滴定板倾斜7刊O胞向下流，判血凝作用为阴性一，或判血凝抑制作用为阳性+。5.4 血凝抑制价z凡能使4个HA单位的抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价。5.5 被检马间隔14d20 d采集的双份马血清经白陶土悬液处理后，血凝抑制价升高2个或2个滴度以上者，判定该匹马近期感染马流感病毒。5.6 红细胞凝集现象被抑制的孔，判为血凝抑制反应阳性;最后判定时间与感作温度有关，温度高时感作时间较短;温度低时可适当延长。3 SN/T 1687-2005 附录A(规范性附录)试剂配方
10、和前处理方法A.1 阿氏液(Alsevers)配方葡萄糖2.05 g 拘橡酸铀0.8 g 拘橡酸0.055 g 氯化铀0.42 g 去离子水加至100mL 上述成分?昆合后加微热溶解，过滤，以O.053 MPa 20 min灭菌，4C保存备用。A.2 PBS辑冲液配方A液0.2mol/L磷酸二氢铀水榕液:NaHzP04 HzO 27. 6 g，溶于蒸馆水中，最后稀释至1000mL 备用。B液0.2mol/L磷酸氢二锅水溶液:NazHP04 7HzO 53. 6 g(或NazHP04 12H20 71. 6 g或Naz HP04 2Hz 0 35.6 g)加蒸馆水溶解，最后加水至1000 mL备
11、用。0.01 mol/L pH7. 4的PBS缓冲液的配制z取A液19.0mL, 11日入B液81.0 nL，为0.2mol/L PB。再加水至2000mL，则成为pH7.4的0.01mol/L的PBS。A.3 马流感抗原前处理方法马流感抗原前处理方法:a) 分别在40mL的马流感病毒鸡胚尿囊液中加人0.5mL含10%吐温-80的PBS(体积分数), 使吐温80的浓度为0.125%(体积分数)。b) 在室温下轻轻1昆匀5min，然后加入20mL乙酶，使终浓度为33.3%(体积分数)，充分棍匀后，放置在40C15 mino c) 静置分层，将液相层(含有破裂病毒粒子的水层)移入玻璃瓶，松开瓶盖，
12、过夜，让过量的乙酷在4C下挥发。A.4 鸡红细胞准备方法无菌采集成年公鸡血液，加入到等量阿氏液中摇匀，置4C冰箱中保存备用。临用前，用20倍体积的0.01mol/L PBS(pH7. 4)洗涤3次4次，每次3000r/min离心5min 10 min，将血浆、自细胞充分洗去至上清破清亮，再将沉淀的红细胞用PBS缓冲液稀释成1%的红细胞悬浮液(RBC)。4 SN/T 1687-2005 A.5 被检血清前处理方法被检马血清前处理方法:用PBS将马血清做1: 5稀释，加入等体积的自陶土悬液混匀，40C孵育20 min(期间混匀2次3次), 4 oC 1 000 r / min离心15min，收集上层血清，得到原血清1: 10的稀释液，此稀释血清用于血凝抑制试验，检测抗体滴度。5 mCON-hFHZ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马流感血凝抑制试验操作规程SN/T 1687-2005 峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷* 开本880X1230 1/16 印张O.75 字数9千字2006年1月第版2006年1月第一次印刷印数1-2000晤书号:155066.2-16611 Y巳定价8.00SN/T 1687-2005
