1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1692.2-2006 非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程ProtocoI of haemagglutination and haemagglutination-inhibition test for African horse sickness 2006-01皿26发布,-ZEEE-E-EE- JiIll-tilaa-Eaz-EEEE-BSIlli-: aa-EE EE-EEEl l il-aalias 圃EEE-E巾iEE-B配配町剧剧剧-Ie-川呻11EE-14阳帽啤t配UUUUUnu川川HHMM山川呻nut-EtuUO MHHHHU
2、HU2 EE-EE-吁AMMMMMmm少ZBasili-J MMMM saagagaaEEanu -EE-aEE-EA-EZEZEZEaEazaeaEE EE-EE -EZEEEa-aEZEB-EfIl la-aSEES 2006-08-16实施- 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布E 前SNjT 1692分为三部分:一一非洲马瘟琼脂免疫扩散试验操作规程;一一非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程;一一非洲马瘟补体结合试验操作规程。本部分为SNjT1692的第2部分。本部分的附录A为规班性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位z中华人民共和留云南出人境检
3、验检疫局。本部分主要起草人:花群义、董俊、周晓黎、杨云庆、龙忠保。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SNjT 1692.2-2006 I SN/T 1692.2-2006 非洲马瘟血球凝集和血球;疑集抑制试验操作规程1 范围SN/T 1692的本部本部分适用于马属2 规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1692的本百件，其随后所有的修改单不包括勘误电内乡协议的各方研究是否可使用这些部分。GB/T 6682 3 试剂和材料3. 1 试荆纯度踪另有说明外，所萃3.2 生理就水的配哥哥配帘!方法见附录A。3.3 pH9.0珊酸盐缓冲霞(BS)配制方法见附录Ao3.4 磷酸盐缓冲液(PB
4、S)配制方法见附录A。3.5 红细胞保存液配制方法见附录3.6 红细胞稀释遛配制方法见阳录3.7 0.3%红细胞悬配制方法见陆录3.8 25%白陶土溶溜配器方法见附录Ao3.9 棕准试剂3.9. 1 非洲马瘟血凝素，由3.9.2 非洲马瘟阳性血清，由指定单位提供。3.9.3 非洲马瘟2月性血清，由指定单位提供。3. 10 器材y 本部分的条款。凡是注日期的引用文禾适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成乱是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本架盘天平、分析天平、离，心机、96孔V型微量血凝极、微型振荡器、10mL真空采血管、可调移液器及加样滴头、恒温箱、普通冰箱等。3. 11 试验动物健康青年
5、马(1岁2岁)。1 SN/T 1692.2-2006 . 4 样品处理4. 1 采样无菌采取被检动物血液10rnL，待血液凝固后，以2000 r/rnin离心10rnin，分离血清，血清40C保存备用。若需长期保存，则置于一200C。4.2被检血清的处理被检血清和吸附剂(pH9.0础酸盐缓冲液和25%白陶土洛液按4:5混合)按1: 1混合后，在室温下充分振荡30rnin，再经560C灭活30rniIi，然后2500 r/rnin离心30rnin，取上清加人1倍体积的1%健康马红细胞生理盐水悬蔽，摇匀后在室温下静止30rnin，再经1000 r/rnin离心15rnin，取上清，即为1 : 4试
6、验血清。5 操作方法5. 1 血球凝集试验5. 1. 1 血球凝集试验见表10表1非洲马瘟血球凝集试验孔号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 血凝素稀释皮1 , 2 l 4 l 8 l 16 1 32 I 1 64 1: 128 1: 256 1: 512 1 : 1024 1: 20481对照生理盐水/L25 L5 5 5 1 怡、卡5l L5h :5 飞1 25 血凝紊/L25 J 25 J 25 ) 25 J 25 J 25 25 25 J 25 25 25 . 、d快去l BS缓冲液/L25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0.3%红细胞悬液/严L50 50
7、 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 感作室温(22C-250C)中静置1h左右判定陆十十斗+叫+十才十十十斗|十十十十|村十才十十叫+十十十十+ 注:十十十十表示红缎胞巳100%凝集，是一层薄膜状，凝集颗粒均匀分布于整个孔底;+十十表示红细胞约75%凝集，但孔底仍有红细胞沉淀成漓状，周闺已形成膜状;+十表示红细胞约50%凝集，血漓局应有凝集颗粒，但不垒膜状;十表示红细胞约25%凝集，血滴周围仅有少量的凝集颗粒;一表示红细胞0%凝袋，虽因漓状沉淀子孔底，周围元凝集颗粒。5. 1. 2 取96孔V型微量血凝板，按表I标记，每孔均加入25L生理盐水，第一孔加入25L血凝素，
8、充分混匀后吸25L至第二孔作等量倍比稀释至倒数第工孔，并从倒数第二孔中吸去25L最后一孔不加血凝素作为红细胞对照。5. 1. 3 每孔加BS缓冲液25L，在微型振荡器上充分摇匀，室温(220C250C)放置45rnino 5. 1.4 每孔加人0.3%红细胞悬液50L，在微型振荡器上充分摇匀后，室温放置1h，判断结果。5. 1.5 血凝素单位的标定5. 1.5. 1 能与红细胞凝集成十十+十的最高稀释度定为血凝素的1个单位(HAU)，表1中的血凝素单位为1: 28。5. 1. 5. 2 在血凝抑制试验中，所腊的血凝素单位要求在25L中含4个HAU，即1: 320 5.2 血球凝集拥制试验5.2
9、. 1 微量且凝抑制试验按表2进行。5.2.2 在96孔V型微量血凝板上，每孔加入BS缓冲液25L。5.2.3 第一孔加火被检血清25L，作等量倍比稀释至第十一孔，弃去25L，第十二孔作红细胞对照SN/T 1692.2-2006 (仅含50L0.3%红细胞悬夜和50LBS缓冲液)。5.2.4 每孔加入4HAU的血凝素25L，在微型撮荡器上充分摇匀。5.2.5 室温下静置45mino 5.2.6 每孔加入0.3%红细跑悬液50L，在微型振荡器上充分摇匀，室温中静置1h左右，待对照红细胞呈明显的困点状时判定结果。5.2.7 每次试验应设已知滴度的阳性血清、阴险血清对照，操作方法按表2进行。表2非洲
10、马瘟血球凝集抑制试磁孔号l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 血清稀释度1: 8 1: 16 1: 32 1: 64 1: 128 1: 256 1: 512 1: 1024 1: 2048 1: 4096 1: 8192 对照BS缓冲液/L二5二5同2550 血清/L25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25 J 25J 25 J 飞、4个HAU血凝索/L25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 室温(22.C25.C)下静置45min 0.3%红细胞悬液/L50 50 50 50 50 50 50 50 50
11、 50 50 50 感作室温(22.C25.C)中静置1h左右判定十十十十+1+叫+叫十十叫十十叫+十叫十十叫一5.3 结果判定弃去5L 5.3. 1 红细胞均匀分散在孔底周围、倾斜血凝板日才不流淌判为100%凝集，记作十十十十;75%凝集记作十十十;50%凝集记作十十;25%凝集i己作十;红细胞集中在孔底中央呈困点、假斜血凝板日才流淌判定为不凝集或血凝抑制，记作一。5.3.2 陆性血清、阴性血清和红细胞对照试验成立的情况下，试验有效，可结果判定。阳性血清对黑孔在已知效价内，血凝完全抑制，即-;阴性血清对照孔的红细胞均匀分散在孔底周围、倾斜血凝板时不流淌，100%凝集，部十十十十;红细胞对照孔
12、的红细胞集中在孔底中央呈圈点、倾斜血凝板时流淌，不凝集。5.3.3 能完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释度判为该血清的血凝抑制效价。5.3.4 非洲马瘟血球凝集试验阳性标准:血清的血凝抑制效价大于等于1: 8者为陆性。如表2中血清效价为1: 160 3 SN/T 1692.2-2006 A.1 生理盘水的配制称8.5g氧化铀保存备用。A. 2. 1 O. 5 mol/L的酣睡溶液础酸(H3B03) 去离子水溶解，冷却后用A. 2. 3 1.5 mol/L 氧化铀(NaCD附录A(规范性附录)试剂配制kPa高压灭菌20min ,40C 加去离子水溶解后，定容至1000 mL, 112 kPa高压
13、灭菌20min，40C保存备用。取0.5mol/L棚酸溶液100mL、1.0 mol/L氮氧化铀溶液24mL、1.5 mol/L氧化铀溶液80mL, 加去离子水定容至1000mL, NaCl H3C6 H5 07 2H2 C6日1206 2H20 A. 4. 1 O. 15 mol/L 氧化铀(NaCD磷酸氨二铀(Na2日P04 12J;!20二:一35.81g 加去离子水定容至500mL, 112 kPa高压灭菌20A., 4.2 0.15 mol/L氧化铀-0.2mol/L磷酸二氢铀(乙液)氧化铀(NaCD4.4 g 磷酸二氢铀(NaH2P04 2H20) 15.6 g 加去离子水定容至5
14、00mL, 112 kPa高ffi灭菌20min，置40C保存备用。A. 4. 3 pH6.4磷酸盐缓冲夜(PBS)mln，直40C保存备用。取甲液32mL和乙液68mL混合，配制成pH6.4磷酸盐缓冲液(PBS)，置40C保存备用。4 加SN/T 1692.2-2006 A.5 红细胞稀释攘的配制取pH6.4磷酸盐缓冲液(PBS)5mL，加入等量pH9.0的BSr昆匀，40C保存备用。A.6 0.3%红缩胞悬液和1%红细胞悬攘的配制埠1岁2岁健康马以无菌操作出颈静脉采血，勾等量红细胞保存被混合放冰箱备用，用前厨生理盐水洗涤四次，为使每次血球悬液浓度一致，规定最后一次离心为2000 r/min
15、离心15min，吸去上清液，血球泥可在普通冰箱保存就且A.7 25%白陶土溶液的取25g白陶土，加去离子水100清液。沉淀用去离子水反复洗涤至10 min，弃上清液，A. 7. 3 25%白陶土称25g酸洗白陶土，250 mL，充分摇匀室温静置1h，弃上5 OON|N.NFH击中华人民共和国出入境检验检疫行业标准非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程SN/T 1692. 2-2006 * 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中留标准出版社秦皇岛印刷厂印刷* 开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数11千字2006年4月第一版2006年4月第一次印刷印数1-2000定价8.00元告书号，155066.2-16746 SN/丁1692.2-2006
