1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1692.3一2006非洲马瘟补体结合试验操作规程Protocol of complement fixation test for african horse sickness 2006-04-25发布060905000058 2006-11-15实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局前言SN/T 1692共分为三个部分:一一非洲马瘟琼脂免疫扩散试验操作规程;一一非洲马瘟血球凝集和血球凝集抑制试验操作规程;一一非洲马瘟补体结合试验操作规程。本部分为SN/T1692的第3部分。本部分的附录A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出
2、并归口。本部分起草单位:中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本部分主要起草人:董俊、周晓黎、花群义、肖荣梅、杨云庆、应雪松。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1692.3-2006 I SN/T 1692.3-2006 非洲马瘟补体结合试验操作规程1 范围SN/ T 1692的本部本部分适用于非洲2 规范性引用文件GB/ T 6682 3 试剂和材料本部分所用水应符合3.1 非洲马瘟补反抗原3. 2 补体:由指定单位3. 3 溶血素:由指定单款。凡是注日期的引用文件，然而，鼓励根据本部分达成协议的文件，其最新版本适用于本部分。3.4 阳性血清:由指定哨位提岳J量用菌l.!_2
3、.霸囊.58卫，SQ!C事榕辑:副m灭能。3. 5 阴性血清:由指定单位提供，使用前1: 10稀释，58.C59.C水浴30min灭能。3.6 阿氏液:按附录A配制。3. 7 4 器械和设备4. 1 将各型滴头1.034 X 4.2 冷冻高速离心机。4. 3 水浴锅。4.4 微量移液器。5 样晶处理将待检动物编号登清60.C、驴血清62.C7j(浴6 预备试验6.1 2%绵羊红细胞悬液制备min，无菌分离血清2份稀释，马血清56.C、斑马血6. 1. 1 取盛有阿氏液100mL的灭菌烧瓶一个，从公绵羊颈静脉元菌采血50mL，混合后置4.C冰箱稳定4d5 d。6.1 . 2 使用时将血液吸入离心
4、管中，1500 r/min离心15min，用吸管吸去上清和红细胞上层的白细胞和血小板薄膜后加BBS缓冲液洗涤，再经1500 r/min离心15min，弃去上清，如此反复洗四次。6. 1. 3 将最后-次洗过的红细胞泥用VBS缓冲液按2%稀释即成(2mL细胞+98mL VBS配制成2%悬液)。SN/T 1692.3-2006 6.2 配制标准溶血管(见表1)6. 2. 1 1. 5 % VBS溶血液制备E取7.85mL纯水加人0.15mL沉淀红细胞，混匀，使红细胞完全溶血后，再加入5XVBS原液2mL。6.2.2 1. 5%红细胞悬液制备z取沉淀红细胞0.15mL，加入9.85mL VBS缓冲液
5、工作液，棍匀。表1标准溶血管配制表单位为毫升溶血度/(%)成分。10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 BBS缓冲液0.375 0.375 0.375 0.375 o. 375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 1. 5%BBS溶血液0.000 0.025 0.050 0.075 o. 100 o. 125 o. 150 0.175 0.200 0.225 0.250 1.5%红细胞悬液0.250 0.225 0.200 0.175 o. 150 O. 125 O. 100 0.075 0.050 0.025 0.000 I 一一L一
6、6.3 榕血素效价测定6.3. 1 每批溶血素用前必须进行效价测定，并标明效价，30d内继续使用时，可不再测定。6.3.2 稀释:先将溶血素作1: 100稀释，即0.2mL(其中含甘油50%)溶血素加入9.8mL VBS缓冲液，然后按表2配制不同稀释度溶血素。襄2溶血素稀释囊单位为毫升稀释度成分1 : 2000 1 : 2 500 1 : 3 000 1 : 3 500 1 : 4 000 1 : 4 500 1 : 5 000 1 : 100X溶血素O. 1 0.1 O. 1 0.1 0.1 0.1 O. 1 BBS 1. 9 2.4 2.9 3.4 3.9 4.4 4.9 6.3.3 按表
7、3建立试验，先将溶血素与红细胞混匀，再加入其他成分。囊3溶血素效价测定表单位为毫升管号l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 成分溶血素溶血素溶血素溶血素溶血素溶血素溶血素缓冲液稀释度稀释度稀释度稀释度稀释度稀释度稀释度溶血素补体对照对照对照1 : 2 000 1 : 2 500 1 : 3 000 1 I 3 500 1 : 4 000 1 : 4 500 1 : 5 000 溶血素0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 O. 1 O. 1 0.1 2%红细胞0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 O. 1 0.1 O. 1 0.1 1 : 20补体0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
8、0.2 0.2 0.2 BBS缓冲液0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.3 0.5 37(; 水浴15 min 结果(例)十+ + 十+十+ 6.3.4 判定:对比标准溶血管(见表1)进行。6.3.4. 1 表3中一为100%搭血，十为75%溶血，十十为50%榕血，+为25%溶血，十+为不溶血。6.3.4.2 对照管出现如下结果时试验及判定结果成立z第8管溶血素对照管不溶血，第9管补体对照管不溶血，第10管缓冲液对照管不溶血。6.3.4.3 能使绵羊红细胞发生完全溶血的榕血素最少量(最大稀释倍数称为一个溶血素单位(即溶血素的效价)。如表3所示结果(例)，该批溶血
9、素效价为1: 4 000，即O.1 mL 1 : 4 000稀释的溶血素含一个溶血单位。SN/T 1692.3-2006 6.3.4.4 溶血素工作液的配制z在本试验中使用二个溶血单位，溶血素工作液稀释度按溶血素效价的2倍计算。根据表3结果(例)，用BBS缓冲液将溶血素作1: 2 000稀释，即为榕血素工作液。6.3.4.5 致敏红细胞的制备:2%绵羊红细胞悬液加等量的二单位溶血素，充分混合后置37C水浴10 min-15 min即成，致敏红细胞置40C冰箱内保存，可用7d。6.4 补体效价测定6.4.1 用BBS缓冲液将补体作1: 20稀释。6.4.2 用BBS缓冲液将抗原作1: 100稀释
10、。6.4.3 按在4建立试验。表4补体效价测定表管成分l 2 3 4 1 : 20补体0.05 0.08 0.11 O. 14 BBS缓冲液0.35 0.32 0.29 0.26 致敏红细胞0.2 0.2 0.2 0.2 37C 水疮20 min 结果(例)+ +十+ 6.4.4 判定:对比标准溶血管(见表1)进行。单位为毫升号5 6 7 对照0.17 0.2 0.23 0.23 0.2 0.17 0.40 0.2 0.2 0.2 0.2 +十十6.4.5 表4中一为100%溶血，+为75%溶血，+为50%溶血，+为25%溶血，+为不溶血。6.4.6 当对照管出现不溶血时判定结果。6.4.7
11、以100%溶血的最小补体量为一个补体单位，表4结果(例)为0.14mL 1 : 20补体。6.4.8 补体工作液配制z本试验使用二单位补体，先根据式(1)算出一单位补体稀释倍数再除2即得工作液的稀释倍数。式中zk一一单位补体稀释倍数;V一一补体用量。20 K = v x O. 2 按表4中第5管为例:一单位稀释倍数=52OM8。二单位补体稀释倍数为28-:-2=14，即(1: 14稀释的0.2mL补体中含2单位补体。)6.5 抗原效价的确认或测定.( 1 ) 6.5. 1 根据供应单位的抗原说明书来决定是否需要进行抗原效价的测定。如不需要测定，则按抗原说明书稀释使用。6.5.2 如需测定，则按
12、下列步骤进行。6.5.2. 1 用VBS缓冲液将抗原依次作21_27稀释。6.5.2.2 用VBS缓冲液将阳性血清依次作21.，2稀释。6.5.2.3 用VBS缓冲液将阴性血清作1: 2稀释。6.5.2.4 按表5建立试验。6.5.2.5 判定:对比标准溶血管(见表1)进行。6.5.2.6 当血清对照管、抗原对照管、补体对照管出现100%溶血，而红细胞对照管出现不搭血时判定抗原效价。3 SN/T 1692.3-2006 6.5.2.7 以阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价。0.1mL该稀释度的抗原为一个抗原单位，本试验使用4单位抗原。2 成分1 : 抗原1 : 2 1
13、: 4 阳1 : 8 o. 1 o. 1 性1 : 16 O. 1 O. 1 血清1 : 32 0.1 1 : 64 1 : 128 O. 1 : 2阴性血清O. 二单位补体BBS缓冲液叫嚣的致敏红细胞7 正式试验成分1 : 2 1 : 4 1 : 8 1 : 16 + + 1 : 32 + + 1 : 64 + + 1 : 128 + + 1 : 2阴性血清4 表5非洲马瘟抗原测定表单位为毫米管号3 4 5 6 7 血清抗原抗原抗原对照对照对照对照稀蒋捷I o. 1 o. 1 o. 1 O. 1 O. 1 O. 1 O. 1 0.1 O. 1 O. 1 O. 1 0.1 O. 1 O. 1
14、0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0. 1 0. 2 0. 2 0.2 0.2 I 1 0. 2 0.2 O. 2 l一一一一lI I I 0.2 I 0.2 I 0.4 37.C 水浴75 min O. 2|0.2 I川Io. 2 I O. 2 I O. 2 I川I0.2 +十+ + + + + + + + + + + 十+ 红细胞对照SN/T 1692.3-2006 8 判定8. 1 抗原效价判定抗原效价判定举例见表6。表6中所示，抗原效价为1: 32，本试验用4单位抗原，即将抗原作1: 8稀释，即0.1mL中含4单位抗原。8. 2 判定方法+ + 50%抑制溶血，即50%结合;+
15、25%抑制溶血，即25%结合;100%溶血，即100%结合J8.3 判定标准成分试验孔1: 10被检血清I O. 1 1: 20被检血清阳性血清阴性血清4单位抗原2单位补体健康鼠脑(HMB)BBS缓冲液致敏红细胞3 4 5 阳性血|阴性血清对照阴性血清对照管、抗原对血时判定被检血清结果。单位为毫升7 8 9 对照O. 2 O. 2 0. 4 O. 2 5 SN/T 1692.3一2006附录A(规范性附录)试剂配制A.1 抗原制备非洲马瘟1、2、3、4、5、6、7，8、9各型疫苗(弱毒)株任选一个或几个型用作补体结合试验抗原均可。本病补体结合试验采用煎糖-丙酣抗原，其方法是:将感染鼠脑加入四倍
16、量8.5%庶糖(冷)溶液，置磨碎器中充分研磨后，徐徐滴加到20倍(冷)丙酣内，边加边搅拌，静置15min后，弃去上清(丙酣)，留下粉红色胶状沉淀物，再加入20倍体积(冷)丙圃，充分搅拌，冰浴1h以上，去上清(丙酣)，将沉淀物置于干燥器内，用真空泵抽干呈均匀粉末，加入相当于匀浆总量的o.4倍的巴比妥缓冲液(VBS)或钙镜盐水，置4.C冰箱中过夜，置研磨器中充分研磨后，经3000 r/min3 500 r/min离心1h，取上清液，置4C冰箱保存备用。用作抗原对照的健康鼠脑(HMB)同样按廉糖-丙酣法处理。A.2 补体制备取健康雄豚鼠五只以上，采血前24h饥饿(只喂水)，由心脏元菌采血后注入试管内
17、，室温下凝固后，置4.C冰箱内10min，经8000r/min离心15min20 min，分装于青霉素瓶或试管内盖紧瓶口，置一20.C冰箱待用。A.3 巴比妥缓冲液(VBS)配制氯化铀(NaCD氯化镜(MgCI 6H20) 氯化钙(CaCI2) 巴比妥巴比妥铀去离子水85.00 g 1. 68 g 0.28 g 5.75 g 2.00 g 2000 mL 将巴比妥加入500mL蒸锢水内，加热榕解后再加入其他成分溶解后，加蒸馆水至2000mL，分装，1. 034 X 105 Pa高压灭菌20min，冷却后冰箱内保存备用。临用时稀释五倍。A.4 阿(A)氏液配制葡萄糖18.66 g 氯化铀(NaC
18、D4. 18 g 拧攘酸铀8.0 g 拧橡酸0.55 g 无离子水1 000 mL 加热溶化后，过滤，分装成五瓶，用5.4X104Pa高压灭菌20min，置4.C冰箱保存备用。6 CON-伺.NSF-hZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准非洲马瘟补体结合试验操作规程SN/T 1692.3一2006赞中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北衔16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷9峰1/16 印张o.75 字数13千字2006年8月第一版2006年8月第一次印刷印数1-2000开本880X1230 7G 定价8.009唔书号:155066.2-17013 1692.3-2006
