1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1693-2006 牛流行性热微量血清中和试验操作规程Protocol of micro-serum neutralization test for bovine ephemeral fever 2006-01皿26发布060712000116 2006-08翩而实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检茂总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛流行性热微最血清中和试验操作规程SNI丁1693-20069夺中国标准出版社出版北京复兴门外三旦河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中00标准出版社秦垒岛印刷广印刷
2、a 开本880X12301/16 印张0.5字数8千字2006年4月第一版2006年4月第次印刷印数12000号令书号:155066 .公16747定价6.00元别高本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位=中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人z董俊、贾建军、杨建明、赵玉书、赵颜润、蒋泽华。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1693 2006 1 SN/T 1693-2006 牛流行性热微量血清中和试验操作规程1 茹围本标准规定了牛本标准适用于牛流2 规范性引用文件GB/T 6682 3 缩路i吾3. 1 3.2
3、 3.3 下列蠕略语适用牛流行热。TCIDso 50 % tissue culture infectious dose 组织培养半数感染量。CPE cytopathic effect 细胞病变。4 设备、材料和试剂4. 1 设备4. 1. 1 超净工作台。4.1.2 振荡器。4. 1.3 倒置显微镜。4.1.4 工氧化碳培养箱4. 1.5 可调单头4.1.6 4. 1.7 微量离J心机。4.2 材料4.2. 1 96孔细胞培养板。4.2.2 微量离心智。4.2.3 细胞培养瓶。4.3 试剂4.3. 1标准种毒、标准阳性血清和阴性血清。4.3.2 BHK-21或Vero细胞。期的引用文件，其随后
4、所有根据本标准达成胁议的各方研究l SN/T 1693-2006 4.3.3 199或MEM培养基。4.3.4 膜蛋白酶。4.3.5 棋牛血清:不含细菌、支原体及无牛流行热抗体，560C灭能30mino 4.3.6 青霉素、链霉素。5 操作步骤5. 1 病毒繁殖将培养24h48 h己长成单层、形态良好的BHK-21细胞，弃去培养液，那维持被将细胞洗涤2次3次，按细胞培养被培养量的10%加入10-2稀释的牛流行热病毒，370C吸附1h(其间轻轻振荡数次。吸去病毒余液，用维持液洗涤一次，加入细胞维持蔽，放37C培养箱内培养，连日观察，当细跑CPE达75%以上时，将培养物放一700C冻结保存。5.2
5、 病毒毒价测定将收获的细胞病毒液冻融三次，以2000 r/min离心10min，吸取上清液作10倍倍比稀释，在微量板上用BHK-21缅跑作50L病毒量的毒价miJ定，每孔的体积为200Lo按改良的Reed占luench或Karber方法计算TCID50，本试验要求毒份达104以上。经测定毒价符合要求的病毒抗原分装小瓶置一700C或液氮中保存备用。超过3个月保存期的病毒用前需重新测定毒价。5.3 被检样品的采集和处理用无菌注射器或专用采血管元商自牛静脉或尾中动脉采血，无菌分离血清编号备用。试验时，被检血清、阳性血清、阴性血清分别经560C温育30min灭能。5.4 中和试验5.4.1 被检血清稀
6、释用移液器吸取已被灭能的每份被检牛血清70L，滴加在微最板上，每孔一份血清直至如完被检血清为止，然后用单头或8头移液器吸取稀释被210L加人被检血清孔内，并充分混合(此时血清被稀释成4倍)，被稀释血清总量为280L5.4.2 病毒稀释试验时，按需要量将被测得毒价的病毒作每50L中100TCID50稀释。1Ytl如病毒毒价miJ定时每50L含有105个TCID50，使用时将病毒作1000倍稀释，即取病毒1mL加维持液999mL。5.4.3细胞对照设4孔细胞对照(每孔加维持液100L)。5.4.4 病毒对照将病毒稀释成每50L中100TCID50、10TCID50、1丁CID5o，每一稀释度作4孔
7、，每孔加病毒悬液50 fLL，维持液50L。5.4.5 胡性血清对照设4孔，每孔加阴性血清50L，每50L中100TCID50的病毒悬被50L。5.4.6 阳性血清对照先将阳性血清作1: 2、1: 4 1 : 27稀释，每一稀释度4孔，每孔加阳性血清50L，每50L中100 TCID50的病毒悬液50Lo5.4.7 病毒鹏血语中和用单头或8头移液器吸取被稀释的血清滴加于96孔徽章板，每份血清加入5个孔，每孔50L，每份血清用一个滴头(96孔板的第6、12列孔空置或作正常细施对照。一块板可检查16份血清)，然后吸取日稀释好的病毒抗原50L，加入每份血清的后4个孔内，第一孔加入稀释液50L丽不如病
8、毒，留作血清毒性对照。将试验板置微型振荡仪振荡混合，在370C5%工氧化服培养箱中中和1ho SN/T 1693 2006 5.4.8 细胞悬班制备在病毒与血清中和期间，将经24h48 h培养长成单层，形态良好的BHK-21细胞，倒弃培养液，用细!维持液将细胞洗涤两次，用分散液将细胞消化吹打分散，并以细胞培养液作适当稀释，按自细胞计数方法计算细胞数量，用培养液配成1.5 X 105 /mL2 X 105 /mL细胞的悬液。5.4.9 培养取出中和好的细胞培养板，每孔加1.5 X 105 /mL2 X 105 /mL的细跑悬液100L，置370C5%二氧化碳培养箱中培养。6 结果判定6. 1 J
9、定条件接种后96h内判定结果。当病毒对摆出现以下结果:一一一每50L中1000 TCID50均出现CPE;一每50L中100TCID50均出现CPE;一一一每50L中10TCID50 75 %出现CPE;一每50L中1TCID5025%50%细胞出现CPEo阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照1: 4元细胞病变，被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常时，方能判定。6. 2 1J定析、准被检血清能抑制50%或50%以上的细胞出现CPE者判为阳性。OONi的白Z军SN/T 1693-2006 黯笨(规范性附录)溶液配制A 16.0 g 0.8 g 2.0 g 1. 16 g 分散班氯化铀(NaCl)氧化饵(KCl)葡葡糖酸酸氢铀(NaHC03)A.1 0.4 g 1. 80 g 1000 mL EDTA-Na2 膜酶水过滤除菌分装备用。199细胞生长液199液辑牛血清青霉素链霉素0.1 g 用碳酸氧铀(NaHC03)调pH值至7.07.2，过滤除菌分装备用。900 mL 100 mL 100000 U A.2 199细胞维持边199被辑牛血清青霹萦链霉素0.1 g 用碳酸氢铀(NaHC03)调pH值至7.07. 2，过滤除商分装备用。970 mL 30 mL 100000 U A.3 侵权必究号一价书一定6.00元版权专有SN/T 1693 2006 、,
