1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1694-2006 马嬉疫微量补体结合试验操作规程Protocol of complement fixation microtitration test for dourine 060712000115 2006-01-26发布2006-08-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检痊总局前本标准依据OIE(诊断试剂和疫苗标准予册)(2004)第五版第2.5.4章制定。本标准的蹄录A、附录B、附录C均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人z筒中友、胡传伟、
2、付蕾、孙延峰、苏永生、孙颖杰。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1694-2006 I SN/T 1694-2006 马嬉疫微量补体结合试验操作规程1 范围本标准规定了马本标准适用于冯属2 规范性引用文件GB/T 6682 3 试剂和材料3. 1 试剂3. 1. 1 试验用蒸馆水3. 1.2 稀释液:巴比3. 1.3 补体结合抗原z3. 1.4 标准阳性血清:由指定单位提供，按说明书使用。3.1.5 标准阴性血清:由指定单位提供，按说明书使用。3.1.6 溶血素:冻干品，使用3. 1. 7 补体z冻干品，使用前3. 1.8 绵羊红细胞储存液蔽，混匀，20C80C保存，3.2
3、被检血清3.2. 1 采血和分离按常规方法采集3.2.2 运送和保存血清采用冷藏运3.3 材料3.3. 1 玻璃试管:103.3.2 试管架。3.3.3 微量移液器。3.3.4 可调连续加样器。3.3.5 96孔U型微量板。4 操作方法4. 1 预备试验4.1.1 3%红细胞悬攘的制备日期的引用文件，其随后所有根据本标准达成协议的各方研究，其最新版本适用于本标准。民被(见第A.1章)加1份血溶血、无腐败气睐。4. 1. 1. 1 绵羊全血充分混匀后，取所需蠢用稀释液洗三次，每次以2000 r/min离心5min，最后一次离心10mino 1 SN/T 1694-2006 4. 1. 1.2 取
4、1份红细胞泥加入到24份稀释液中，充分混匀，制成红细胞悬液。4. 1. 1.3 取250L红细胞悬浮液加入到4.75mL蒸馆水中，充分裂解(液体清亮)。4. 1. 1.4 取100L加入到96孔微量板孔内，平行加8个孔。4. 1. 1.5 周酶标仪子540nm波长下测光密度值(OD值)，算出平均OD值，代人校正红细脂浓度公式，见式(1): 稀释液加入量-平均OD值红细胞悬液量/0.115一红细胞悬液量.( 1 ) 4.1. 1. 6 取校正红缩胞放度时所需的稀释液量加入到红细胞悬液中即得3%红缅胞悬液。4. 1. 2 溶血素效价的测定4. 1. 2. 1 稀释溶血囊取0.2mL溶血素原液，加入
5、到19.8mL生理盐水中，制成1: 100稀释的溶血素，再按表1稀释成不同稀释倍数的溶血素。表1溶血素的稀释单位为毫升稀释倍数1 : 500 1 : 1 000 1 : 1 500 1: 2000 1: 3000 1 : 5 000 1: 10000 1 : 100 1: 100 1: 100 1: 100 1 : 1 000 1 : 1 000 1 : 1 000 溶血索蠢溶血素1.0溶血素2.0溶血素0.5溶血素0.5溶血素1.0溶血紊1.0溶血索1.0巴比妥缓冲液4.0 18.0 7.0 9.5 2.0 4.0 9.0 4. 1. 2. 2 制备不同稀释倍数的溶血素敢敏红细胞取7个试管，
6、每管加1.5 mL 3%的红细胞悬液，然后分别缓慢加入不同稀释倍数的洛血素1.5 mL, 混匀，370C水洛箱中感作15mino 4. 1.2.3 溶且素效价的确定将补体原液预稀释至1: 150，按表2在96孔U型徽章板上测定溶血素效价。表2溶血素效价测定单位为微升孔号1 2 3 4 5 6 7 稀释液50 50 50 50 50 50 50 1 : 150补体25 25 25 25 25 25 25 不同稀释倍数致敏红细胞50 50 50 50 50 50 50 溶血索稀释倍数1 : 500 1 : 1 000 1 : 1 500 1 : 2 000 1 : 3 000 1 : 5 000
7、1 : 10 000 感作37C水浴振荡30min(每隔5min振荡1次，下同2 000 r/mi双水平离心3min，取上清液100L分别注入另一96孔U型微量反应板中，与标准比色孔比较，确定出现100%溶血时溶血素的最高稀释倍数为其效价，即此时溶血素的浓度为该反应体系下的1个标准单位，正式试验时溶血素的工作浓度为2个标准单位。4. 1.3 制备致敏红细晦悬渣按油定的榕血素效价稀释洛血素2个标准单位，缓慢加入到等莹的3%绵羊红细胞悬浮被中，混合均匀，置37C水浴箱中感作15mino 4. 1.4 补体效价的测定补体预稀释至1: 5，做两组重复，按表3在96孔U型微量板上进行测定。2 叩SN月1
8、694一2006表3补体效份制定单位为微升孔号1 2 3 4 5 6 1 : 150补体15 20 25 30 35 40 稀释液60 55 50 45 40 35 第一次感作37C水浴振荡30min 致敏红缎胞50 50 50 50 50 50 第二次感作37C水浴振荡30min 2 000 r/min水平离心3min，取上请被100L分别转移人另一96孔U型微量板中，于.540nm 被长下读OD值，与标准比色孔比较，确定出现50%溶血时补体的最高稀释倍数为补体的效价，即该放度为此反应体系下1个补体标准单位。正式试验补体工作浓度为2个标准单位。4. 1. 5 抗原效价的WliJ定4. 1.5
9、. 1 新购抗原可按说明书稀释使用。4.1.5.2 如保存过久需要重新确j定时，可按下述步骤进行:a标准陆性血清和标准阴性血清分另别4用稀释液作1: 5稀释，置5臼8Cl水k浴箱中灭能30min b汕)将标准捂性血f清霄作倍比稀释(见酣录B盼)。c) 将抗原按1: 10作倍比稀释(见附录B)。d) 建立方阵试验，用96孔U型微量板按附录B进行。e) 敢出微量反应板，2000 r/min水平离心3min，与标准比色孔(比色孔的配制见附录。比较，观察溶血度，记录结果。f) 抗原效价的确定:在对照成立时，与阳性血请各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价，即为1个单位抗原，正式试验抗原使用
10、2个单位。4.2 正式试验4.2.1 灭能将标准阳性血清、民性血清和被检血清置58C水浴箱内灭能30min;驴、骤血清于62C灭能30 min, 4.2.2 试剂及血清稀释4.2.2. 1 试剂的稀释榕血索、抗原、补体按预试验测定的效价稀释至工作浓度。4.2.2.2 血清的稀释标准阳性血清、阴性血清和被检血清起始稀释度为1: 5。一般标准阳性血清作6个稀释度，阴性血清可作3个稀释度，定性试验被检血清可作一个稀释度，翻tl定抗体效价可根据需要进一步稀释。4.2.3 试验程序4.2.3. 1 基本操作程序在96孔U型微量板上进行，25L血清十25L抗原十25L补体37C水浴振荡感作40min 十5
11、0L致敏红细胞37C水浴振荡感作30min。同时设立标准阳性现清对照、阴性血清对照、抗原对照、补体对照和红细胞对照。4.2.3.2 定性试验加样法每个已稀释的样品加3个孔，第一孔不加抗原，加等量稀释液代替，作为抗补体对照。4.2.3.3 血清效份甜定加样法对样品进行倍比稀释，每个稀释度加1孔(起始稀释度需加2孔，1孔作为抗补体对照)，如表4，取SN/T 1694-2006 出微量反应板，2000r/min水平离心1min，比照标准比色孔，记录结果。表4班清效价的测定单位为微升, 红细胞对照补体对照2个补体单位0个补体单位1个补体单位血清抗补体对主址:照Fr一一抗原对血清试验孔孔号血清抗原75
12、75 62.5 50 稀释液12.5 25 25 补体第一次感作50 50 致敏红细胞第二次感作判定5 5. 1 的抑制溶血程度相比照标准结果判定各对照的结果如下时，可判定被检血清;否则，补体的效价应建新测定，并重做4.2的正式试验。2个单位补体对照:1001个单位补体对照z0个单位补体对照:抗原对照:100红结胞对黑z血清拭补体对照z5.2 为可疑;痕量洛血或完全不被检血清1: 5 洛判为阴性。4 A.1 向民滚(AIsevers)的制备成分z氯化锦元水拧攘酸铀葡萄糖蒸馆水至隙，录A规范性附录)溶涟配制方法:用拧棱酸调pH值至6.1，过滤除菌，用法:采血时，1.2份阿民液加1份血椒，60A.
13、2 自比妥缓冲液(VBS)的制备成分:5，5二乙基巴比妥酸5，5工乙基已氧化铀六水含氧化镜氧化钙蒸锢水2000 mL SN/T 1694-2006 方法:首先用1000mL蒸饵水将各种盐洛解，再用500mL热蒸馆水溶解巴比妥酸，待巴比妥酸冷却后加入1000 mL盐溶被中，最后用蒸儒水补至2000 ，sl昆句是o.104 MPaO. 112 MPa灭商20 min，分装储存于40C备用。用法:5 SN/T 1694-2006 孔号1 : 10 1: 20 1 : 40 抗原25 25 25 1 : 5 25 25 25 1 : 10 25 25 25 阳1 : 20 25 25 25 除1: 4
14、0 25 25 25 血清1 : 80 25 25 25 1 : 160 25 25 25 1 : 320 25 25 25 1 : 5阴性血清25 25 25 补体工作效价25 25 25 稀释液第一次感作致敏红细胞50 50 50 第二次感作附录B(规范性附录)抗原效价测定表表B.1方阵试验抗原稀释度1: 80 1 : 160 1: 320 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1: 640 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
15、 37C振荡感作40min 50 50 50 50 37C振荡感作30min 血清对照25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 注:抗原对照、补体对熙、血清对照为100%溶血，且红细胞对照不溶血，试验成立。单位为微升抗原补体红细胞对照对照对照25 25 25 25 50 75 50 50 50 抗原与阴性应请各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价，其含量为1个单位。6 C.l 制备现红素附录C(规范性附录)标准比色孔的制备SN/T 1694.;_2006 取3%绵羊红细胞3.0mL，加入到9.6mL蒸馆水中，充分破解，再加入4.25%氧化铀2.4mLo C.
16、2 制备0.6%绵羊红细胞取3%绵羊红细胞2mL加入到8mL稀释液中。C.3 标准比色管的制备标准比色管的制备按表C.1进行。表C.l标准比色管配制备法试验管1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 溶血度/c%)。10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 血红紊/mL。0.2 0.4 0.6 0.8 1. 0 1. 2 1. 4 1. 6 1. 8 2.0 0.6%绵羊红细胞/mL2.0 1. 8 1. 6 1. 4 1. 2 1. 0 0.8 0.6 0.4 0.2 。C.4 标准比色孔的配制取0%100%溶血度洛液各100L，分注相应的微量孔内，540nm读OD值。CON-gSH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准玛撞撞微量补体结合试验操作规程SN/T 1694-2006 争夺中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北衔16号邸政编码:100045同址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷9号开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数15千字2006年4月第一版2006年4月第一次印刷印数1-20009号书号:155066 216748 定价8.00元SN/T 1694 2006
