1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1695-2006 马焦虫病微量补体结合试验操作规程Protocol of complement fixation microtitration test for equine piroplasmosis 2006-01-26发布. l a-EE-E橱EBa-, EE-EEZEEBE配EA斗副部副由副酣剧即14ZE-EE-唱E晶川咄咄咄t配配UU们UU川nUMMMMMMM山明4EE-tttEUU们才54阳睛睛EEE76liltuuuu川nUMM川吁吁吁16UUUIo ta-ZEISE-EE EEE-固l a-EE- 2006呻08-16实施h1 2
2、气飞._!. ，、- -.，._ .川、J中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘦总局SN月1695-2006前亩本标准主要依据OIE(诊断试剂和疫苗标准予册)(2004)第五版第2.5.6章制定。本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性蹄录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:筒中友、付营、胡传伟、孙延峰、苏永生、孙颖杰。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN月1695一2006马焦虫病微量补体结合试验操作规程1 范围本标准规定了马本标准适用于马属2 规范性引用文件GB/T 6682 3 试剂和材料3.
3、 1 试剂3. 1. 1 试验用蒸锚3.1.2 稀释液z巴t3. 1.3 补体结合抗原23. 1 4 标准llE性lfiL清z3. 1. 5 标准阴性血清:由指定单位提供，按说明书使用。3. 1. 6 溶血素:冻干品，使用前用蒸悟水溶解至规定容积。3.1.7 补体:冻干品，使用前用3. 1.8 绵羊红细胞储存液液，混匀.20C80C保存，3.2 被检血清3.2. 1 采血和分离血按常规方法3.2.2 遣送和保存血清采用冷藏3.3 材料3.3. 1 玻璃试管:103.3.2 试管架。3.3.3 微最移液器。3.3.4 可调连续加样器。3.3.5 96孔U型微量板。4 操作方法4. 1 预备试验4
4、. 1. 1 3%红细胞悬液的制备日期的引用文件，其随后所有根据本标准达成协议的各方研究版本适用于本标准。氏液见第A.1章如1份lfiL、元溶血、无腐败气味。4. 1. 1. 1 绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释被洗三次，每次2000 r/min离心5min.最后一次离心10mino 1 SN/T 1695-2006 4.1. 1. 2 取1份红细胞泥加入到24份稀释液中，充分棍匀，制成红细胞悬液。4.1. 1. 3 取出250L红细胞悬浮掖加入到4.75mL蒸锚水中，充分裂解(液体清亮)。4. 1. 1.4 取100L加入到96孔微量板孔内，平行加8个孔。4. 1. 1.5 用酶标仪于54
5、0nm波长下读光密度值(OD值)，算出平均OD僚，代入校正红细胞浓度公式，见式(1):稀释液加入蠢-平均OD值红细胞悬液量/0.115一红细脂悬液最( 1 ) 4. 1. 1.6 取校汪红细胞浓度时所需的稀释液量加入到红细胞悬液中即得3%红细胞悬液。4. 1.2 溶血素效价的制定4. 1. 2. 1 稀释溶血萦取0.2mL溶血素原眩，加入到19.8mL生理盐水中，制成1: 100倍稀释的溶血素，再按表1稀释成不闰稀释倍数的榕血素。表1溶血寰的稀释单位为毫升稀释倍数1: 500 1 : 1 000 1 : 1 500 1: 2000 1 : 3 000 1 : 5 000 1 : 10 000
6、1: 100 1: 100 1: 100 1: 100 1 : 1 000 1 : 1 000 1 : 1 000 溶血素量溶血素1.0溶血素2.0溶血素0.5溶血素0.5溶血索1.0溶血素1.0溶血素1.0巴比妥缓冲液4.0 18.0 7.0 9.5 2.0 4.0 9.0 4. 1. 2. 2 制备不同稀释倍数的溶血素敌敏红辑胞取7个试管，每管加1.5 mL 3%的红细胞悬蔽，然后分别缓慢加人不同稀释倍数的溶血素1.5 mL, 混匀，370C水浴箱中感作15mino 4. 1.2.3 溶血素效价的确定将补体原液预稀释至1: 150，按表2于96孔U型微量板上测定榕班素效价。表2溶血素效价测
7、定单位为微升孔号1 2 3 4 5 6 7 稀释液50 50 50 50 50 50 50 1 : 150补体25 25 25 25 25 25 25 不同稀释倍数致敏红细胞50 50 50 50 50 50 50 溶血素稀释倍数1 : 500 1 : 1 000 1 : 1 500 1 : 2 000 1 : 3 000 1 : 5 000 1 : 10 000 感作370C水浴振荡30minC每隔5min振荡1次，下同)2 000 r/min水平离心3min，取上请被100L分别注人另一96孔U型微最反应板中，与标准比色孔比较，确定出现100%溶血时溶血素的最高稀释倍数为其效价，即此时溶血
8、素的浓度为该反应体系下的1个标准单位，正式试验时溶血素的工作放度为2个标准单位。4. 1.3 制备致敬红细胞悬液按测定的溶血素效价稀释溶血素，缓慢加入到等量的3%绵羊红细胞悬被中，混合均匀，置370C水浴箱中感作15mino 4. 1. 4 补体效价的那定补体预稀释至1: 150，做2组重复，按表3在96孔U型微量板上进行测定。2 SN/T 1695-2006 表3补体效价测定单位为微升孔号1 2 3 4 5 6 1 : 150补体15 20 25 30 35 40 稀释;夜60 55 50 45 40 35 第一次感作37C水浴振荡30min 致敏红细胞50 50 50 50 50 50 第
9、工次感作37C水浴振荡30min 2 000 r/min 水平离心3min，取上清液100L分别转移人另一96孔U型徽章板中，于540nm 波长下读OD值，与标准比色孔比较，确定出现50%溶血时补体的最高稀释倍数为补体的效价，即该浓度为此反应体系下1个补体标准单位。正式试验补体工作浓度为2个标准单位。4. 1. 5 抗膜效价的测定4. 1.5. 1 新购抗原可按说萌书稀释使用。4. 1. 5. 2 如保存过久需耍重新测定时，可按下述步骤进行za) 标准llE性血清和标准阴性血清分别用稀释液作1: 5稀释，置580C水浴箱中灭能30mino b) 将标准阳性血清作倍比稀释(见附录B)。c) 将抗
10、原按1: 10作倍比稀释(见附录B)。d) 建立方阵试验，用96孔U型微量板按附录B进行。e) 取出微量反应板，2000 r/min水平离心3min，与标准比色孔(比色孔的配棋见附录C)比较，观察溶血度，记录结果。f) 抗原效价的确定:在对照成立时，与阳性现清各稀释度发生抑制溶血最强的拭原最高稀释度为拭原效价，即为1个单位抗原，正式试验抗原使用2个单位。4.2 正式试验4.2. 1 灭能将标准陆性血清、阴性血清和被检血清景580C7j(浴箱111:反能30min;驴、骤血清于620C灭能30 min 4.2.2 试剂及血清稀释4.2.2.1 试剂的稀释溶血索、抗原、补体按预试验测定的效价稀释至
11、工作浓度。4.2.2.2 血清的稀释标准陪性血清、胡性血清和被检血清起始稀释度为1: 5。一般标准阳性血清作6个稀释度，阴性血清可做3个稀释度，定性试验被检血清可作一个稀释度，1JilIJ定抗体效价可根据需要进一步稀释。4.2.3 试验程序4.2.3.1 基本操作程序在96孔U型微最板上进行，25L血清十25L抗原十25L补体370C7Jc洛振荡感作40min 十50L致敏红细胞370C水浴振荡感作30mino同时设立标准阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、补体对照和红细胞对照。4.2.3.2 定性试验加样法每个日稀释的样品加3个孔，第一孔不加抗原，加等量稀释液代替，作为抗补体对照。4.2.
12、3.3 血清效价测定加样法对样品进行倍比稀释，每个稀释度加1孔(起始稀释度需加2孔，1孔作为抗补体对照)，如表40取SN/T 1695-2006 出微最反应板，2000 r/min水平离心1min，比照标准比色孔，记录结果。5 判定孔号血清抗原稀释液补体第一次感作致敏红细胞第二次感作5. 1 被检血清效份比黑标准比色孔5.2 结果判定表4血清效价的测定血清抗血清试验孔补体X才照抗原对H百单位为微升补体对照2 个补体单位1 。红个个组补补胞体体X才直在单照位位50 I 62.5 I 75 I 75 25 I 12.5 I 0 50 各对照的结果如下时，则可判定被检血清，否则，补体的效价应重新测定
13、，并重辙4.2的正式试验。2个单位补体对照:100%溶血。1个单位补体对照:500个单位补体对照:抗原对照:100红细胞对照:血清抗补体对照:同说明被检血清1: 5 血判为阴性。4 与试验孔的抑告tl溶血程度相为可疑;完全不溶或瘦量溶A.1 阿氏液(Alsever的的制备成分:氧化铀无水拧攘酸铀葡萄糖蒸馆水至附录A(规范性附录)溶擅配制方法g用拧攘酸调pH值至6.1，过滤除菌，用法:采血时，1.2份阿氏被加1份血液，60A.2 巴比妥援冲液(VBS)的制备成分:5，5二乙基巴比妥酸5，5二乙基巴比妥锦氧化铀六水合氧化镜氧化钙蒸馆水SN/T 1695-2006 方法:首先用1000mL蒸馆水将各
14、种盐溶解，再用500mL热蒸馆水溶解巴比妥酸，待巴比妥酸冷却后加入1000 mL盐溶液中，最后用蒸馆水补至2000 mL，混匀，0.104 MPa O. 112 MPa灭菌20 min，分装储存于40C备用。用法z5 SN/T 1695-2006 孔号1 : 10 1: 20 1: 40 抗原25 25 25 1 : 5 25 25 25 1: 10 25 25 25 阳1 : 20 25 25 25 险1 : 40 25 25 25 血清1 : 80 25 25 25 1 : 160 25 25 25 1 : 320 25 25 25 1 : 5阴性血清25 25 25 补体工作效价25 2
15、5 25 稀释液第一次感作致敏红细胞50 50 50 第工次感作附录B(规范性附录)抗服效价测定表表B.1方阵试验抗原稀释度1: 80 1 : 160 1 : 320 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1 : 640 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 37C振荡感作40min 50 50 50 50 37C振荡感作30min 血清对照、25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 注:抗原对照、补体对照、
16、血清对照为100%溶血，且红细胞对照不溶血，试验成立。单位为微升抗原补体红细胞对照对照对照25 25 25 25 50 75 50 50 50 抗原与阳性血清各稀释度发生抑制浴血最强的抗原最高稀释度为抗原效价，其含囊为1个单位。6 目C.1 制备血红素附录C(规范性附录标准比色孔的制备SN/T 1695-2006 取3%绵羊红细胞3.0mL，加入到9.6mL蒸馆水中，充分破解，再加入4.25%氧化饷2.4mLo C.2 制备0.6%绵羊红细脂取3%绵羊红细胞2mL加入到8mL稀释液中。C.3 标准比色营的制备标准比色管的制备按表C.1进行。表C.1标准比色管自己制备法试验管1 2 3 4 5
17、6 7 8 9 10 11 溶血度/(%)。10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 血红素/mL。0.2 0.4 0.6 0.8 1. 0 1. 2 1. 4 1. 6 1. 8 2.0 0.6%绵羊红细胞/mL2.0 1. 8 1. 6 1. 4 1. 2 1. 0 0.8 0.6 0.4 0.2 。C.4 标、准比色孔的配制取0%100%溶血度溶液各100L，分注相应的徽章孔内，540nm读OD值。OONilmmF 问Z中华人民共和愿出入境检验检疫行业标准玛焦虫病微量补体结合试验操作规程SN月1695-2006铃中国标准出版社出版北京复兴门外三旦河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦袅岛印刷厂印刷9毛开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数15千字2006年4月第一版2006年4月第一次印刷印数1-2000头1695一2006书号:155066 2-16749 定价8.00元
