1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1698-2006 猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程2006皿01-26发布Protocol of micro-serum neutralization test for porcine Aujeszky s disease 060712000111 2006-08翩而实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 1698-2006 自日中一同本标准参照世界动物卫生组织(OIE)(诊断试验和疫苗标准手册)(2004年第五版)，并参考中华人民共和国迸出境动物检疫规程手册)(1997)据定。本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由国家
2、认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人z鱼海琼、李力施、罗琼、朱道中。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程SN/T 1698 2006 1 范围2 规茹性言i用文件3. 1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 EDTA 乙二股四乙酸二锅。TCIDso 半数组织培养感染囊。PK-15 猪肾传代结胞。Vero 非洲绿猴肾细胞。CPE 细胞病变。PRV 伪狂犬病病毒。凡是注日期的引用文件，其随后所有，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究用文件，其最新版本适用于本标准。4 试剂和材料4.
3、1 试剂一一细胞培养被:PK-15细胞培养液为EagleMEM，Vero结胞培养液为199，参见酣录A。一一细胞维持液:参见阳录Ao一，细跑消化液z参见附录Ao1 SN/T 1698一2006一一一细跑:PK-15细胞或Vero细胞。一一病毒:PRV标准毒株，由指定单位提供。而一一对照血清:PRV标准阴、阳性血清，由指定单位提供。一一水z本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格。4.2 器材细胞培养瓶、96孔细胞培养板、吸管、移液器及相应的吸头;离心机、低温冰箱、水浴箱、超净工作台、二氧化服培养箱、倒置显微镜。5 试验方法5. 1 预备试验5. 1. 1 血清处理将阴性对照血清、南性对
4、照血清和被检血清均置于560C水浴箱加热灭活30mino 5.1.2 病毒繁殖按接种量约为生长液的1/10的比例将猪PRV标准毒株接种到适当的单层细胞上。370C吸附1h , 加入维持液。当75%95%单层细胞出现CPE时，冻融该培养物2次3次，1000r/min离心10min, 将上清液分装于小瓶中，一200C或一700C低温保存待用。5. 1.3 毒价测定测定病毒效价，按照10倍递减方式稀释病毒。每一个稀释度(10-1 10-8)在96孔板上由AH各加8孔，放于370C工氧化碳培养箱培养3d后，判定出现CPE的孔数，按Reed占t1uench法或Krber法测定TCIDso，参见附录Bo用
5、100乘以TCIDso得出稀释度并按此稀释度稀释种毒即为100TCIDso的工作病毒。5.2 正式试验5.2. 1 迦清稀释所有被检血清在96孔细胞培养板上平行检测双份，每份4个孔，3个稀释度，即被检血清毒性对照孔、被检血清1: 2、1: 4、1: 8稀释孔，见表1。以样品1为倒，A1，A3，A4孔各加50L稀释液(无血清营养液)，A2孔加100L稀释液，吸取100L被检血清加至A2孔，吸吹均匀后移50L至A3孔，吸吹均匀后再移50L至A4孔，吸吹均匀后弃去50L，从A2孔吸取50L至A1孔吸吹均匀，再从A2孔吸出50L弃去。阴、南性对照血清一般稀释8个稀释度:1 : 2 1 : 256，如表
6、LA9至H9共8孔各加50L稀释液，腹取50L阳性对照血清力日至A9孔，吸吹均匀，移50L至四孔，依此类推，直到H9孔，最后一孔弃去50LoA10至H10共8孔各加50L稀释液，吸取50L阴性对照血清加至A10孔，吸吹均匀，移50L至B10孔，依此类推，直到H10孔，最后一孔弃去50Lo同时在第11列和12列如入100L稀释液，设立细胞对照孔。表1血清稀释分布情况96子Ll(血清2(被检3(被检4(被检5(血清6(被检7(被检8(被检9(阳性10(阴性11(细胞12(细胞细胞毒性血清)血清)血清)毒性血清)血清血清对照)对照)对照)对照)板对照)对照)A 样品11: 2 1: 4 1 : 8
7、样品51 : 2 1 : 4 1: 8 1: 2 1 : 2 B 样品11: 2 1 : 4 1: 8 祥品51 : 2 1 : 4 1: 8 1: 4 1: 4 C 样品21: 2 1 : 4 1: 8 样品61 : 2 1 : 4 1: 8 1: 8 1 : 8 D 样品21 : 2 1 : 4 1: 8 祥品61 : 2 1 : 4 1: 8 1 : 16 1 : 16 E 样品31: 2 1: 4 1: 8 祥品71 : 2 1 : 4 1: 8 1 : 32 1 : 32 F 样品31 : 2 1: 4 1 : 8 样品71 : 2 1 : 4 1: 8 1: 64 1: 64 2
8、SN/T 1698-,-2006 表1(续)96孔l(血清2(被检3(被检4(被检5(血清6(被检7(被检8(被检9(阳性10(阴性1l(细胞12(细胞级胞毒性血清)血清)血清)毒性血清)血清)血清)对照)对照)对照)对照板对照对照)G 样品41: 2 1 : 4 1 : 8 样品81 : 2 1: 4 1: 8 1 : 128 1: 128 H 样品41: 2 1: 4 1: 8 样品81 : 2 1 : 4 1: 8 1 : 256 1: 256 5.2.2 工作病毒的稀释病毒工作放度为100个TCIDso按照5.1.3中毒价视tl定结果稀释病毒待用。5.2.3 工作病毒自归试验将工作病毒
9、稀释成0.1个TCIDso、1个TCID50、10个TCID5。的王个稀释度，另取一块细胞板，先加50L无血清营养被至96孔细胞板上，再将0.1个TCIDso、1个TCID50、10个TCID50、100个TCIDso稀释度的病毒敲在此96孔板上各加8孔，做好标记。5.2.4 中和反应吸取病毒工作液50L加至表1中细胞板的第2列、第3列、第4列，第6列、第7列、第8列及院、阳性血清对照孔，细胞对照孔和血清毒性对照孔不加，将细胞板置于37C5%二氧化碳培养箱中1h。5.2.5 细胞悬夜的制备用10mL吸管将细脑消化被加至已形成单层且生长良好的细胞上，轻轻转动细胞瓶使消化液充分接触细胞后弃去消化蔽
10、，照此重复一次，然后加入适量细胞营养液吹打数次即成细胞悬液，一般需要细胞最为3X105个/mL5.2.6 细胞悬渡的加入取出已经中和好的细脂板，所有孔均加入细胞悬液100L，将细胞板置37C5%二氧化碳培养箱培养，并在培养3d6 d后观察CPEo6 结果判定正式试验所用病毒的实际含量应在100TCID50300 TCID5。范围内，病毒回归试验结果中10个或10个以上TCID50的细胞孔应全部出现CPE，l个TCID50的细胞孔应有2孔6孔出现CPE，O.l个TCID50的细胞孔应全部不出现CPE。阴性对照血清应全部出现CPE，阳性对照血清应从A9至H9由无CPE到出现CPE，细胞对黑孔应无C
11、PE且生长良好，血清毒性对照孔应元CPE，所有对照成立后，可判定中和试验结果z大于或等于1: 4稀释度的双孔血清100%无CPE时，该血清判为阳性;反之，双孔均出现CPE时判为阴性;当双孔中有一孔无CPE，另一孔有CPE时判为可疑，需重复检甜。着重复检测后仍有一孔元CPE，另一孔有CPE，可判为阳性。3 SN/T 1698 2006 A.1 MEM 先按照商品说明清、3%七谷氨酷蹄。A.2 199细腾培养液先按照商品说明书配制199A.3 维持液含2%辑牛血清的A.4 细胞消化溜膜酶4 EDTA 氧化铀CNaCD氧化梆(KCD葡萄糖碳酸氢铀CNaHC03)1%酷红双蒸水附录A(资料性附录营养液
12、及消化被配方细胞营养被加10%棋牛血细胞营养液加10%棋牛血清。繁衍兮了在伊dSN/T 1698-2006 附录B资料性附录病毒半数组织培养感染最TCID50的计算部tl定病毒效价时可按Reed-Muench法或Krber法测定TCIDso，假设按10倍递减方式稀释病毒(10一11。一勺，各加8孔，加入细胞培养后每一个稀释度的CPE结果如表B.1。广十条B才吃毒俞-测是掘的癖变摇果可可细胞孔观察结果数二i累计出现出现CPE累计细胞孔数病毒液细胞孔总CPE细胞孔细胞孔稀释度出现CP巴孔|不出在CPE孔出现CPE孔不出现CPE孔俨J 命令飞所占百分比的比率1。一18 。27 o 100 1 10-
13、2 2 、8 。19 二1 /I9 100 1 I、1 11 1/ 12 91. 6 0.875 10-3 z 7 1 104 3 5 吼/6:卢/ 10 40 0.375 10 1 7 1/ 1 1/ 13 14 O. 7 O. 125 / f 8p / ,/ 。10-6 。/21 21 。1。一7。8 。29 。、1? 37: 。10-8 。8 。37 B. 1 Reed心1uench法由B.1结果可知，该病毒株的TCIDs。在10-310-4之间，其丁CIDso可按式。.1)计算:一19TCIDso口高于50%的稀释度91.6牛二儿亏做)-50 91. 6(高于50月的百分数)-40(低
14、天50%的百分数)飞(B.1 ) huzo -hzi-3 A哇-Fzhdi1十川qus 一mMnu 飞J1iF Th gI 一节B. 2 Krber法可按式(B.2)计算z式中zL一一最高稀释度的对数;d一一稀释对数之间的差;5一一阳性管比事总和。由表B.1结果可知，lgTCIDso口-1-1(3.375-0.5)骂:一3.875，TCIDso= 1Q-3.S75jO.5 mL，计算结果与Reed-Muench法近似。飞、飞向B.3 简化Krber法实际工作中，测定毒价时通常出现以下情况设100%稀释孔出现CPE的病毒最高稀释度为t*, SN/T 1698 2006 10-(十2)稀释皮的病变
15、孔数必须为oJ:6 稀释皮:1。一110一210-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10 病变孔数:8 8 8 .8 8 8 4 0 此时Krber法可以简化如下zTCIDso =10-E飞。T50口f十l:!.tf一一-100%稀释孔出现CPE的病毒最高稀释度。l:!.t=用接种孔数除接种哈孔数与1.0-(-+1】稀释度的病变孔数之扣，再减去lno本例中，t*注=6l:!.t出(8十的/8-1/2、T50=t*十l:!.t:-6十1:-7TCID50 =1。一ETSO=107/0雪5mL 100 TCIDso =100/10-7口10OONlSFH在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准猪伪狂犬病微量监请中和试瞌操作规程SN/T 1698-2006 * 中国标准出版社出版北京复兴门外三盟河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦垒岛印刷厂印刷* 开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数12千字2006年4月第一版2006年4月第一次印刷印数1一2000击毛书号:155066 2-16752 定价8.00元SN/丁16982006
