1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1724-2006 进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程Phytosanitary procedure of Bursaphelenchus xylophilus CSteiner & Bhrer) Nickle for entry coniferous raw woods , wood products and wood packing materials 2006-01-26发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2006-08斗6实施060712000083 目。吕本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由国家认
2、证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位:中国检验检疫科学研究院。SN/T 1724-2006 本标准参加起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准起草人:葛建军、周国梁、沈培垠、詹国平。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 1724-2006 进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程1 适用范围本标准规定了进本标准适用于对松材线虫的进境检疫。2 术语和定义下列定义和术语适用于本标准。2. 1 学名:Bursa phelenc lenchida)、滑刃科CApchus)。2. 2 木材wood 带皮或
3、不带皮的原木、锯木、木板、木片和木屑等。2. 2 原木raw woods 2. 4 树皮bark 木本植物的外层部2. 5 木制品wood 2. 6 木质包装材料用于承载、包装、铺垫、模、垫木、枕木、衬木等。2. 7 蓝变blue-stain 、木制品和木质包装材料中Nematoda)、滑刃目CAphe滑刃线虫属CBursahelen-、水托盘、木框、木桶、木轴、木在松树木材中，由于长嗦壳属Ceratocystisspp.、色二抱属Diodiaspp.等多种蓝(青)变真菌的存在，使木材变为蓝灰色。2. 8 媒介天牛vector beetIe 在自然条件下，松材线虫需依靠墨天牛属的几种天牛才能被
4、传播到未发病的寄主上，这些传播松材SN/T 1724-2006 线虫的天牛称之为媒介天牛。2.9 扩散性3龄幼虫CLm)dispersal larvae Lm 在秋末冬初，罹病松树木质部内松材线虫蜕变为扩散性3龄幼虫(Lm)，和普通3龄幼虫CL3)相比，Lm角质膜显著增厚，体腔内含物浓稠，肠内积聚类脂小滴，特别耐饥饿、耐干燥和耐低温等不良环境。2. 10 持久性4龄幼虫CLw) dauer larvae Lw 在媒介天牛幼虫越冬和化蜗期间(冬季至春季)，Lm;不断向天牛踊室集中，并且在媒介天牛羽化时大量的Lm蜕变为持久性4龄幼虫(LII) 0 LII形态变化很大，除角质膜增厚外无口针，食道退化
5、，头圆丘形，尾端明显指状，肠内积聚类脂，贮存糖原。Lw特别抗干燥，体表覆盖保护性胶粘物适于媒介天牛的传播。3 符号下列符号适用于本标准。n-测计的样本数目L一二虫体体长(m或mm)G一一一体长(L)/虫体最大体宽b一二体长CL)/唇至食道腺基部的长度C一一体长(0/尾长(胆门至尾尖)V一一头顶至阴门的长度/体长CL)XI00%St一一口针长度(m)Sp一一交合刺长度(m)4 原理松材线虫在松树体内的分布与媒介天牛的活动有关，当松材线虫危害松树并导致松树死亡后，为适应不良的环境，病树木质部内松材线虫蜕变为扩散性3龄幼虫CLm)，当媒介天牛化蝠后，Lm则向踊室聚集，并在媒介天牛羽化时大量的Lm蜕变
6、为持久性4龄幼虫(-11) ，一旦天牛羽化，LJi便进入到天牛的气管系统内，随羽化后的媒介天牛飞出。天牛携带LII飞出病树后，通过天牛在健康松树上补充营养时或在濒死和已经死亡的松树上产卵时所造成的伤口，松材线虫侵入松树体内，完成其侵染循环。松材线虫的侵染循环和形态学特征是该检疫操作规程的依据。5 仪器、用具及药品5. 1 仪器、用具光学显微镜、解剖镜、恒温箱、40目网筛、500日(或400目)网筛、纱布、浅盘、漏斗、酒精灯、斧头、锯子、麻花钻(手王)、烧杯、小培养皿、载玻片、盖玻片、线虫挑针、吸管、漏斗架、止水夹、橡皮管等。5.2 药品酒精、福尔马林(40%)、冰乙酸、甘油、三乙醇胶、蒸悟水、
7、指甲油(无色)、乳酣油、封片蜡等。6 现场检症6. 1 查验单证检查报检时随附的单证并确认进境原木、木制品和木质包装材料的产地、品种、数量;验证来自美国、日本和韩国货物的元木包装声明或热处理证书是否与进境货物相符;根据货主或代理人提供的报检单证，对来自松材线虫疫区国家和地区的针叶木、木片等木制品实施松材线虫检疫。SN/T 1724-2006 6.2 抽样对于来自于松材线虫疫区国家的进口针叶树原木，按每批总数比例的0.5%5.0%随机抽查，但抽查的原木数不得少于20根。重点检查有无天牛危害症状。对于来自于松材线虫疫区国家的造纸用针叶树木片，分舱别、分层次按棋盘式选10点50点杆取原始样品并制成复
8、合样品。对于来自于松材线虫疫区国家的木制品和木质包装材料须全面检查其外表后，确定针叶木存在的位置、数量。用记号笔标记存在蓝变、具天牛虫孔、新伐木(具明显该材种气味或新鲜韧皮部)、含水量大或具树皮的可疑罹病木，并将其带回实验室检查。未发现上述可疑罹病木的，按每批总数比例的0.5%5.0%随机抽样，但不得少于2件。6.3 现场样晶采集用于锯、斧头或其他工具，采集标记部位的样品，每采样点在采集时应至少采集到样品横截面中心部位。将采集的每个小样均分为两份，均分后的小样混合装在2个密封袋中，进行编号、记录，作为该批货物的提合待检测样品和留存样品。若有必要，也可将针叶树的可疑病木材直接带回实验室后再进行上
9、述样品的采集。采集的样品临时存放在50C250C环境中，如采集的样品较干燥(含水量14%以下)，可在待检测样品的密封袋中放置一小块潮温的纱布或吸水纸，以保证样品送检过程中松材线虫的存活率。待检测的样品应在12h内送到实验室进行线虫的分离、检测。6.4 货物的后期监管现场采集样品后的货物，在未获得最终检测结果前，须接受严格的检疫监管。货物卸运地必须相对隔离和易于接受监管，其周边必须元松材线虫寄主树林，以防止病变木材的散失和昆虫的逃逸。7 实验室检验7.1 线虫分离线虫分离的具体方法参见附录A。若发现媒介天牛成虫，既要保护天牛的完整性以利天牛的种类鉴定，又要检查是否携带松材线虫，可以采取局部分离线
10、虫的方法，即将天牛的触角端部或胸部腿节取下，捣碎后用漏斗法或洗盘法分离线虫，也可直接浸泡于加水的表面皿或小培养皿中，2h后在解剖镜下直接观察是否有线虫。7.2 制片观察根据上述分离方法，如分离到线虫，将线虫置于解剖镜下，挑取或吸取线虫至含1滴水的载玻片上，使线虫沉底并位于水滴中央，于酒精灯火焰上过5s6 s致使线虫恰好被杀死为止，加盖盖玻片后，待将制好的玻片置于光学显微镜下观察。8 松材线虫的形态特征8. 1 伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)的主要形态特征和测计值虫体细长(值大于30)，体长O.4 mml. 5 mm。唇高，继缩。口针有圆而小的基部球。排泄孔常位于中食道球后。雌虫
11、阴门有角质膜阴唇或阴唇突;后阴子宫囊长。尾有时圆，尾端圆锥形或锐指状，末端有或无尾尖突。交合刺成对、窄，常有拉长的顶尖(apex)和显著的味(rostrum)，雄虫尾弓形，短指状，端生交合伞。生殖乳突数目可变。无引带。8.2 松材线虫的主要鉴定特征雌雄成虫均呈蠕虫状，长1mm左右;口针基部微厚;中食道球几乎充满体腔，食道腺细长，约为虫体食道处体宽的3倍4倍长，背部覆盖;排泄孔位于食道和肠的交接处，有时位于神经环水平处;半月3 SN/T 1724-2006 体位于中食道球后约三分之二体宽处。雌虫单卵巢，前伸，卵母细胞常单列;后阴子宫囊长;阴门约于虫体后部四分之三处、被后伸、宽的阴门盖(阴门前唇)
12、所覆盖;尾亚圆筒状，末端宽圆，无尾尖突，或末端有尾尖突，但长度一般不超过2m。雄虫交合刺大，成对，不愈合，交合刺近端嗦突明显，尖细，远端有清晰的盘状膨大(突起);雄虫尾弓状，尾端尖细，侧面观呈爪状，为端生的短卵状交合伞包裹(见图1)。l曲在虫;2牛一一雄虫;3一一雄虫交合刺;4一一雄虫尾部交合伞;5一一交合刺侧面观;6 雌虫前端;7 雌虫阴门;7 8lO-雌虫尾部。4 图1松材线虫Bursaphelenchusxylophilus (Steiner & Bhrer) Nickle(仿Mamiya等，1972;Nickle等，198 1) 8. 3 松材线虫的形态测计值松材线虫的形态测计值见表l
13、。类别南京表1松材线虫的形态测计值中国台湾SN/T 1724-2006 日本美国L/m 1140(9601 310) 1 257.2土82.5 810(710 1 010) 1029. 5(7411 235) 43(3448) 雌虫雄虫a b c V 5,/ p.m L/m a b C 5;m 5p/m 9 结果判定9. 1 结果初判断1070(9101 190) 47. 6(3554.的15. 1 (1 以雌、雄成虫的形态特征为依据，符合上述形态特征可鉴定为松材线虫。11. 1(9. 812. 6) 27. 7(19. 634. 5) 73 . 7(7175. 7) 15. 3(13. 51
14、6. 2) 1 021(8111 188) 4O. 8(31. 649. 9) 9. 7(8. 611. 5) 33. 9(28. 638.1) 15. 104. 916. 2) 29. 5(2732.的目前，伞滑刃线虫属中有效种近50个，大多数种与昆虫丰县品旦虫和穿钻性害虫有关，常在针叶树木内出现，它们都是食真菌性的。同时瞄线虫和其血回国圃脏要由墨天牛属的媒介天牛传播，故此线虫的鉴定中易出现错误.I才线虫与a-圄眶跚酶烧latus)形态最为相似，它们均出现在针叶树木材内，并且有a理翻圃盟国防大和略目圈圈圈圈圈擅瞩噩噩阴k雌虫尾部特征，松材线虫雌虫尾端宽圆，元尾尖突，或有矗禽提竭圄噩快突长卤.
15、胃n(主嚼蜡醒一二脑左右);而拟松材线虫尾端指状，有尾尖突，长度在3.在口岸的检疫中，有时矗醋酶的幼虫，可矗回国黠湿培养或砸蹦疆培养，获得成虫后再对线虫作进一步的鉴定(参见9. 2 结果复核对第1次截获松材线虫线虫分离液、临时玻片、照相10 检瘦处理一旦发现截获松材线虫，须验检疫部门许可的检疫处理措施。门样品的保存线虫雌成虫、雄成虫的装材料采取退货、销毁或检保存样品经登记和经于人签字后妥善保存2个月。如发现松材线虫，该样品至少需保存6个月，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，含松材线虫的样品，必须经灭活处理，处理方法为销毁或热处理(木材的中心温度达到56C时，处理30min以上)。目SN/T 1
16、724-2006 A.1 漏斗分离法其装置是将漏斗(直径10cm、末端安装个止7水k夹。附录A(资料性附录)松材线虫分离方法具体操作步骤如下:将劈好的细木片用双重纱布包好，放在盛满清水的漏斗中(由于线虫的趋水性和自身的质量，线虫离开植物组织，在水中游动，最后沉降到漏斗末端的橡皮管中)012 h24 h后打开弹簧夹，用表面皿或小培养皿接取约5mL水样直接镜检;或用离心管接取约5mL的水样，静置20min 左右或1500 r/min离心3min，倾去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液后，再进行镜检。A.2 浅盘分离法浅盘分离法装置由两只不锈钢浅盘、线虫滤纸或宽幅卫生纸组成。-只浅盘口
17、径小，可套放于另一只浅盘内，并且其底部用粗筛网(10目)取代，被称为筛盘;另一只是正常浅盘。将线虫滤纸(无专用线虫分离滤纸的可用擦镜纸或双层卫生纸代替)平放在筛盘筛网上，用水淋温，接着将劈好的细木片撒在其上;从两只浅盘的夹缝中注水，以淹没供分离的材料为止;在15C28C下放置1d3 d后，将浅盘中的水连续通过500目的筛网，然后将500目标准筛上的含线虫的残留物冲洗到小培养皿中，供镜检。A.3 其他分离方法用斧头将木材劈成带的木片(厚度在0.5cm以下)，浸泡于大盆或塑料桶中，于室温下浸泡ld3 d后移去木片，将盆或桶中的水连续通过40日和500目的筛网，然后将500目标准筛上的含线虫的残留物
18、冲洗到小培养皿中，供镜检。该方法简单方便，可分离的样品数量大，得到的线虫量多。使用以上方法分离松材线虫时，室内温度应要保持在15C28C之间;当室温过高或过低时(影响线虫的分离效果)，须在恒温设施中进行松材线虫的分离。6 SN/T 1724一2006附录B(资料性附录)松材钱虫成虫的培养当分离得到的线虫数量较少或仅分离到形态和松材线虫形态相似的线虫幼虫时，可通过培养获得大量成虫，以便进一步鉴定。B.1 病木保温保温培养将样品锯成小段，置于烧杯中，加少量清水，使木段下端浸在水中，木段上端用温纱布覆盖，在250C保温保湿培养放3d4 d，倒取杯中水液，可获得较多雌雄成虫。或将样品适量喷温，放于塑料
19、袋里扎紧，置于250C恒温培养箱中3d4 d取出重新分离，可获得较多雌雄成虫。B.2 单异活体培养通常用灰葡萄抱(Botrytiscinerea)或多毛抱(Pestalotiasp. )培养松材线虫。制取马铃薯一葡萄糖一琼脂(PDA)培养基平板，挑取PDA斜面上的一小块灰葡萄抱，移在PDA平板上，放入250C280C恒温箱培养，经4d5 d菌丝可铺满平板。将线虫集中在指形管中，加入线虫消毒液后加塞振荡1mino经过几分钟消毒处理后，线虫也沉降到指形管的底部，用移液管吸去上层药液，最后用灭菌水洗涤2次3次。在长满灰葡萄抱的PDA平板上接种表面消毒了的线虫悬浮液0.5mL，在250C280C恒温箱
20、中培养平板，一般经过一周便可产生大量线虫。常用于松材线虫消毒的消毒液及处理时间见表B.1，也可将待消毒的线虫直接浸泡在表B.1所列的抗菌素液中，于40C下过夜。B. 1 松材钱虫消毒的消毒液及处理时间抗菌素种类及浓度处理时间/min0.002%放线菌酣和0.1%硫酸链霉素混合液510 0.1%链霉素硫酸盐20 0.1%孔雀绿5 3%双氧水15 0.05%0.1%乙氧基乙基氯化柔15 当线虫虫量很少时可以采取简易的线虫表面消毒方法，即在灭过菌的载玻片上滴2滴。0.002%放线菌酣和0.1%硫酸链霉素混合消毒液和1滴灭菌水，然后用线虫挑针将少量线虫挑到第1滴上述线虫消毒液中，1min后挑至第2滴消
21、毒液中，1min后再将线虫挑到灭菌水中，1min后就可以将线虫直接用于接种培养。当实验室条件差时，可以用线虫挑针将少量线虫直接挑到灭菌水中洗涤几次，也可达到不太严格的线虫消毒的目的。CON-叮NhFH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进境针叶树原木、木制晶和木质包装材料中松材线虫的检擅操作规程SN/T 1724-2006 峙中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷并印张O.75 字数15千字2006年5月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2006年5月第-版印数120007巳定价8.00当告书号，155066.2-16781 1724-2006
