1、GB/T 174941998 前 言 马传染性贫血病(简称马传贫，下同)的流行，曾给我国养马业造成巨大的经济损失。经过多年的防治，在全国范围内取得显著成效，已达到控制标准。为消灭马传贫，提供一个先进有效、特异敏感、反应快速、操作方便、易于推广的检测方法，是十分必要的。为此制定马传染性贫血病间接ELISA技术规程。 马传贫间接ELISA技术自1983年建立以来，已在全国主要养马省区推广应用十余年之久，在马传贫防治工作中发挥了重要作用。特别是研制的试剂实现了标准化、商品化，并以低耗优质的产品质量，为该方法推广应用奠定了基础，在这方面我们已走在世界前列。 本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录
2、。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由中华人民共和国农业部畜牧兽医司归口。 本标准由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草。 本标准起草人：戴玉坤。 1 范围 本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA技术规程的测定原理、仪器设备、试剂、配制溶液、操作步骤、结果判定。 本标准适用于检测马血清中的马传贫疫毒抗体。可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马匹的检疫，马传贫病马的定性；也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标
3、准最新版本的可能性。 NY 1271987 马传贫酶联免疫吸附试验(ELISA间接法)抗原、酶标记抗体制造及检验试行规程 3 测定原理 用特制的马传贫病毒抗原(NY 127)，包被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有马传贫病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原抗体复合物，再与酶标记的抗体(抗马免疫球蛋白)反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性、定量抗体测定。 4 仪器设备 页码，1/5GB/T 1749419982006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbhH174940k.htm 吸管：1mL、5mL、10mL； 量桶：50
4、mL、100mL、1000mL； 烧杯：50mL、100mL； 玻璃滴管：每滴体积约2030 L； 血清稀释板：20孔板每孔容积为1mL； 定量加液器：1mL分装定量； 微量吸液器：50 L、100 L； 分析天平：感量0.001g； 托盘天平：感量0.01g； 水浴锅； 酶标测试仪。 5 试剂 除特别注明外，所用试剂皆为分析纯。 磷酸氢二钠； 磷酸二氢钠； 氯化钠； 柠檬酸； 磷苯二胺(化学纯)； 过氧化氢(浓度30)； 吐温-20(Tween-20)； 白明胶(Gelatin white)(E.Merck)； 健康牛血清(无污染)； 浓硫酸(纯度9598)； 酶标记抗体(冻干品，活性和特异
5、性应符合NY 127，见附录A)； 马传贫病毒抗原包被板(活性和特异性应符合NY 127，见附录B)； 阴性及阳性对照血清(冻干品，活性和特异应符合NY 127)。 页码，2/5GB/T 1749419982006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbhH174940k.htm6 配制溶液 6.1 磷酸盐缓冲液(0.02mol/L pH7.2 PBS) 6.1.1 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O )71.64g，先加适量的去离子水加热溶解，最后定容至1000mL，混匀。 6.1.2 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二
6、氢钠(NaH2PO42H2O )31.21g，先加适量的去离子水加热溶解，最后定容至1000mL，混匀。 6.1.3 量取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL，称取氯化钠38g，混在一起，用去离子水溶解稀至5000mL。 6.2 洗液(0.02mol/L pH7.2 PBS-0.05吐温-20) 量取0.02mol/ LpH7.2 PBS1000mL，加入0.5mL吐温-20，混匀。 6.3 血清及酶标记抗体稀释液(0.02mol/L pH7.2 PBS-0.05吐温-20-0.1 白明胶-10健康牛血清) 量取洗液(6.2)100mL，加入100
7、mg白明胶加热溶解，冷却后量取90mL，加入健康牛血清10mL，混匀。 6.4 底物溶液(pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，内含0.04邻苯二胺及0.045过氧化氢) 6.4.1 pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸(C6H8O7H2O)21.01g，用去离子水溶解，定容至1000mL。量取243mL与0.2mol/L磷酸氢二钠溶液(6.1.1)257mL混合，于4冰箱中保存不超过一周。 6.4.2 称取40mg邻苯二胺，溶于100mL pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液(6.4.1)中( 用前从4冰箱中取出，在室温下放置2030min平衡温度)，待溶解后，加入150 L过氧化氢混匀。根据试验
8、所需量按此比例增减。现用现配，剩余液废弃。 6.5 终止剂：2mol/L硫酸 量取浓硫酸4mL加入32mL去离子水中，混匀。 7 操作步骤 7.1 洗板 去掉抗原包被板的密封条及板孔保护膜，向各孔注入洗液，浸泡约3min，甩干，再重新注入洗液，重复洗三次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。 7.2 加被检血清及对照血清 将被检血清登记编号后，用50 L微量吸液器依次各取50 L加入到血清稀释板的各孔内(每份血清各用1个加样嘴)。用定量加液器，将0.95mL的稀释液(6.3) 依次加入装有血清的各孔内，使血清做120倍稀释。混匀后用100 L微量吸液器将被检血清依次加入抗原包被板孔内(每份血清各
9、用1个加样嘴)，每份血清加两个孔。 页码，3/5GB/T 1749419982006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbhH174940k.htm 每块反应板均需设阳性对照及阴性对照血清。冻干的阴、阳性对照血清，按瓶上标注量加入稀释液 (6.3)，溶解后加入上述包被板孔内。阴、阳性对照血清各两孔，每孔100 L。盖好板盖，置37水浴 中，保温1h。 7.3 洗板 甩掉板孔内的血清，向各孔注入洗液，按(7.1)方法洗三次，甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。 7.4 加酶标记抗体 按瓶签标注量，用稀释液(6.3)将冻干酶标记抗体溶解混匀后，每孔加 100 L，盖好板盖
10、，置37水浴中，保温1h。 7.5 洗板 甩掉板孔内的酶标记抗体，向各孔注入洗液，按(7.1)方法洗三次， 甩净孔内残液，再在滤纸上拍打吸干。 7.6 加底物溶液 用100 L微量吸液器，每孔加新配制的底物溶液100 L，在室温下避光反应大约510min(见附录C)。 7.7 终止反应 用玻璃滴管每孔滴加终止剂1滴。 8 结果判定 8.1 目测法 阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判为马传贫病毒抗体阳性。如遇颜色反应较弱，但与阴性对照血清孔还有差异者，用目测法难以判定时，则以比色法测定结果为最终结果。 8.2 比色法 用酶标测试仪，在波长492nm
11、下，测定各孔OD值，阳性对照血清的两孔平均OD值大于1.0，阴性对照血清的两孔平均OD值小于或等于0.2为正常反应。按以下两个条件判定结果：被检血清的两孔平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比，大于或等于2，且被检血清的两孔平均OD值在0.2以上者，判为马传贫病毒抗体阳性，否则为阴性。 附 录 A (标准的附录) 马传贫酶标记抗体质量的说明 马传贫酶标记抗体(冻干品)，系山羊抗马IgG与辣根过氧化物酶的结合物。对标准阳性血页码，4/5GB/T 1749419982006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbhH174940k.htm清的平切终点(PEP)应0.
12、25 g/mL，平切滴度(PT)应110240倍。酶标记抗体用二倍平切终点的浓度，对标准阳性血清与标准阴性血清的120倍稀释液进行测定，阳性吸收值应1.0，阴性吸收值应0.2。在-20下可保存2年。 附 录 B (标准的附录) 马传贫病毒抗原包被板质量的说明 马传贫病毒抗原包被板，系马传贫病毒抗原包被40孔或96孔聚苯乙烯板制备而成，对标准阳性血清的终点滴度120480倍。在-20下可保存2年。 附 录 C (标准的附录) 底物溶液作用时间的说明 底物溶液的作用时间与环境温度有关，如温度较高，酶催化作用就快，颜色反应则快。如温度低，酶的催化作用就慢，颜色反应则慢。因此底物的作用时间多依阳性和阴性对照血清颜色变化为准。当阳性对照血清孔呈鲜明的黄色，而阴性对照血清孔无色或基本无色时即要终止反应。标准中规定的底物作用时间510min，是在不同温度条件下的大致范围。 页码，5/5GB/T 1749419982006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbhH174940k.htm
