1、中华人民共和国出入境检验检藏行业标准SN/T 1673-2005 对虾传染性皮下和造血器官坏死病聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction (PCR) for infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus of shrimp 2005-09-30发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局2006-05-01实施060509000067 目。嚣本标准的附录A为规商性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验
2、检疫局。本标准主要起草人:刘盔、史秀杰、何俊强、高隆英、杨锦舜、江育林。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1673-2005 I 1 范围对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程SN/T 1673一2005本标准规定了用聚合酶链反应技术检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(lHHNV)的方法。本标准适用于对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测及鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新
3、版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/丁6682-1992分析实验室用水规格和试验方法CeqvISO 3696 :1 987) 3 试剂和材料3.1 水:符合GB/T6682-1992中级水的规格。3.2 Taq酶:SU/L， -20C保存.不要反复冻融或握度剧烈变化。3.3 dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。3.4 引物:法度为40mol!L。其序列如下:77012F:5-ATC GGT GCA CTA CTC GGA-3 77353R: 5 -TCG TAC TGG CTG TTC ATC-3 3.5 元水乙醇:分析纯.使用前预冷到
4、20C。3.6 矿物油:要求无DNAgi母和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。3. 7 标准分子量:推荐使用pUC19DNA/M1 CHII ) ，各片段大小依次为501bp、404bp、331bp、242 bp、190bp、147bpo 4 器材和设备4.1 PCR扩增仪。4.2 电泳仪。4.3 微量移液器及吸头。4.4 紫外观察灯或凝胶成象仪。4.5 恒温培养箱。4.6 普通冰箱和超低温冰箱。4. 7 离心机和离心管。4.8 制冰机。5 取样和制样5.1 取样5. 1. 1 取活或濒死的对虾组织作为样品.死亡2h后不可采用。处理前要将样品放在冰上。如果2h SN/T 1673-2005
5、以后才能处理.应将样品保存在95%乙醇中.乙醇体积是样品体积的10倍以上.放置在室瘟下可保存1个月。5. 1. 2 仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作样品。取虾头时，用灭菌剪刀和慑子去除眼睛、头胸甲、所有的胸部附器和头部以后的腰部。5. 1.3 成虾，取附肢或血淋巴作为样品。5. 1. 3. 1 取附股时，用灭菌剪刀剪去头部和腹部两侧的附肢，如触角、顿足、步足和游泳足，用小剪刀剪碎。5. 1. 3. 2 取血淋巴时，先用1mL针管吸取500L10%的拧穰酸盐溶液(见第A.1章)，然后在针管前插上一个26号的针头。抓住对虾，使腹部朝上。将针头水平地插入第和第二对游泳足之间，并直插到最后对胸部附器的凹陷
6、处。缓慢吸取血淋巴。血淋巴样品需保存在-70C。5.2 制样15C条件下，在1.5 mL Eppendorf管中首先加入25mg100 mg组织或200L血淋巴拧攘酸盐混合液，加入150LCTAB洛液(见第A.2章)，用匀浆器将样品匀浆成糊状。再加CTAB帘液到900Lt昆匀后置于25C作用2h, 6 IHHNV核酸的鉴定6. 1 核酸抽提首先加800L抽提液1(见第A.3章)，充分?昆合至少30S: 12 000 r/min离心5min，取上层水相;再加700L抽提液2(见第A.4章)，充分?昆合30S: 12 000 r/min离心5min，取上层水相;然后加入1.5倍体积的一20C元水乙
7、醇.混匀后，一20C放置6h以上:15 000 r/min离心30rnin，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，37C干燥20min或抽真空干燥:最后加12L水溶解后，作为PCR模板。6.2 PCR扩增反应体系为100L:水62L、dNTP2L、上游引物和下游引物各2.5L、25mmol/L氧化镜(MgClz) (见第A.5章)10L、10倍Taq酶浓缩缓冲液(见第A.6章)10L、模板10L、Taq酶1L。如使用无热盖的PCR扩增仪.需在反应混合物上覆加50L矿物油。?昆匀后低速离心，让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。94C变性4min: 94 C变性1min、55C退火1r
8、nin、72C延伸1rnin. 35次循环:72C延伸10rnin刊。C保温。6.3 设立对照6.3. 1 在6.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。6.3.2 取含有已知IHHNV病毒的对虾组织悬液作为陌性对照，阳性对照物由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。6.3.3 取正常的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。6.3.4 取等体积的水代替模板作为空白对照。6.4 琼脂糖电珠用丁BE(见第A.7章)电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含1g/rnLEB，见第A.8章)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将8L样品和样品缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳
9、时设立DNA标准分子量作对照。5V/cm电泳约30minc 7 结果判定在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。2 SN/T 1673-2005 7.1 PCR后阳性对照会出现一条356bp的DNA片段，阴险对照和空白对照没有该扩增带。7.2 在7.1成立的前提下，待测样品电泳后在相应356bp DNA位置上有扩增带者，取PCR扩增产物测序，同参考序列(参见附录B)进行比较.序列相似性在95%以上，可别断待测样品结果为阻性。7.3 无扩增带或扩增带的大小不是356bp的为阴性。3 SN/T 1673-2005 A.1 梓棒酸盐溶液酣录A(规范性附录)试剂配制10.0 g拧攘酸纳加90
10、.0rnL蒸锚水溶解。A.2 CTAB 按2%CTAB, 1. 4 rnol!L laCl , 20. 0 rnrnol!L EDTA , 20. 0 rnol/L Tris-HCl pH 7.5配制。用前加琉基乙蹲到终浓度为0.25%。A.3 抽提液1酣叫王氯甲皖异戊离事.用1.0 rnol/L pH 7.9土0.2Tris 饱和酣:二氯甲烧:异戊醇按25: 2,1 : 1 的比例混合.密闭避光保存。A.4 抽提液2-，甲皖异戊醇，将王氯甲烧和异戊薛按24: 1的比例说合.密闭避光保存。A.5 MgCb 25. 0 rnrnol!L A.6 Taq酶用10倍浓缩缓冲液(lOXbuffer)T
11、ris叩HCl氧化押(KCI)TritonX也100500.0 rnrnol/L pH 8.8 500.0 rnrnol/L 1% A.7 TBE电泳缓冲渣(5倍战结搜)Tris 54.0 g 础酸27.5 g EDTA 2.9 g 加水勤1 000.0 rnL 用5.0 rnol!L的HCl调pH到8.0。A.8 EB(Ethidiurn Brornide，核酸染色剂)用水配制成10.0rng/rnL的浓缩液。用时每10.0rnL电泳液或琼脂中加1.0L。A.9 7:臭酣蓝指示荆溶液(6X上样缓冲液)澳盼蓝100rng，加双蒸水5rnL，在室?且下过夜，:寺j容解后再称取煎精25g，加双蒸水
12、溶解后移入i臭盼蓝溶液中，摇匀后定容至50rnL.加入氢氧化的;容;夜1滴，调至蓝色。4 SN/T 1673-2005 附亲B (资料性附录)IHHNV扩增产物的序列1 J主TCGGTGCACTAC1、CGGAAAACTGAACACT GGCCTAGTAA CAAGAACAGG 50 51 AGACTC人AACACCTTCCf气ICTACAAAACCT CATCGGAAAG TCC1ACGCTC 100 101 TCITCGAAGA ACCCAGAAIC AGTCAAf气IACAGTGGACGA C1丁CAAACTC150 151 CT1TTCGAAG GATCAGAC1T AGAAG1AAA
13、C 1气1AAAACACCAAGAGTCAGA 200 201人叹了TATGGGACGAl气1ACCAATCTTCf主DTCAACAAACAAA GAIi气1AGACT250 251人CTGGGTACCTCCAGCTGl气I、GGTAAAGCTC ACAAACAAG AACAAAAACC 300 301 TTCCACCTGA CAAGAC人AATAAAAGGCC丁C丁CAGACAGGATGAACAGCCA 350 351 GTACGA 356 3 OON-的khFHZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程SN/T 1673-2005 中国标准出版社出版北京复兴门外玉皇河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷A 开本880X12301/16 印张O.75 字数10千字2006年1月第一版2006年1月第次印刷印数1-2000定价8.00元女书号:155066.2-16597 SN/T 1673-2005
