1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1675 2005 鱼真铜虹彩病毒聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction (PCR) for red sea-bream iridovirus (RSIV) of fish 2005-09-30发布2006-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局060509000065 理自U高本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:XiJ莲、商万红、罗卫、黄逊、吕建强
2、、秦智锋。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1675-2005 范围鱼真铜虹彩病毒聚合酶链反应操作规程本标准规定了用聚合酶链式反应技术检测鱼真踊虹彩病毒的方法。本标准适用于鱼真蜗虹影病毒的检测及鉴定。2 规范性引用文件SN/T 1675-2005 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件.其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/丁6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO 3696
3、:1 987) GB/丁18088-2000出入境动物检疫采样3 试剂和材料除特别说明外，本标准使用试剂均为分析纯。3. 1 水:应符合GB/T6682-1992中一级水的规格。3.2 Taq酶:5U/L.20C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.3 dNTP:含dCI、P、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL几-，3.4 引物:浓度为40mol/L。其序列如j: RSIV-F ,5-GTG ACT GCA CAC CAA TGG AC习RSIV-R:5-GGC TTT CTC AAT CAG CTT GC-3 3.5 元水乙辞:分析纯.使用前预冷到一20C。3.6 矿物油:使用无热盖
4、的PCR仪时使用，要求无DNA酶。3. 7 核酸分子量标准参照物。3. 8 1:臭代十六烧基二甲胶(CTAB)。3. 9 1:真化乙链(EB)。3. 10盼。3. 11 三氯甲:境。3.12 异戊醇。3.13 琉基乙辞。3. 14 三连甲基氨基甲烧(Tris)。3. 15 珊酸a3.16 乙二股四乙酸二铀(EDTA), 3. 17 r.臭酷蓝。3. 18 蔚糖。3. 19 盐酸。4 器材和设备4.1 PCR扩增义。SN/T 167巴一四20054.2 电泳仪。4. 3 做量移液器及吸头。4.4 紫外观察灯。4.5 恒温培养箱。4.6 普通冰箱和低温冰箱。4. 7 匀浆器。4.8 离心机和离心管
5、。4.9 制冰机。5 取样和制样5.1 取样对鱼的解剖采样.如果是体长小于4cm的组茵取整条鱼，体长4cm6 cm的组茵取内脏(包括肾):体长大于6cm的鱼则取脑、肝、肾、牌。成熟雌鱼还需取卵巢;夜。陌鱼的采样数量按GB18088 2000 的规定采样。5.2 制样在150C条件下，在1.5 mL Eppendorf管中首先加入25mglOO mg组织，加入150LCTAB溶液(见第A.l章)，用小剪刀剪碎，然后用匀浆器将样品均浆成糊状。再加C丁AB港液到800L混匀后置于250C作用2人6 RSIV核酸的鉴定6. 1 核酸抽提首先加350L抽提液l(见第A.2章)，充分说合至少30S: 12
6、 000 r/min离心5min，取上层水相;再加350L抽提液2(见第A.3章)，充分棍合30S: 12 000 r/min离心5min，取上层水相;然后加入1.5倍体积的一200C无水乙醇.混匀后，一200C放置6h以上;15 000 r/min离心30min，小心倒去上清液.倒置于吸水纸上，吸干液体，370C干燥20min或抽真空干燥:最后加10L水溶解后，作为PCR模板。6.2 PCR扩增反应体系为100L:水62L、dNTP2L、上游引物和下游引物各2.5L、25mmoL/L的MgC12(见第A.4章)10L、10倍T叫酶放培缓冲液(见第A.5章)10L、模板10L、Taq酶lL。如
7、使用无热盖的PCR扩增仪，需在反应?昆合物上覆加50L矿物油。i昆匀后低逮离心，让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。940C变性4min:940C变性1min、580C退火1min，720C延伸1min，35次循环;720C延伸10min;40C保温。6.3 设立对照6.3. 1 在6.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。6.3.2 取含有巳知RSIV的病毒悬液或核酸作为阳性对照，阳性对照物由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。6.3.3 取正常的鱼组织抽提核酸作为荫性对照。6.3.4 取等体积的水代替模板作为空白对照。6. 4 琼脂糖电泳用TBE(见第
8、A.6章)电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖(含1g/mLEB，见第A.7章)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6L样品和澳酣蓝指示剂溶液(见第A.8章)按比例:昆匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量栋准参照物作对照。5V/cm电泳约0.5h.当澳酣蓝到达底部时停止。SN/T 1675-2005 7 结果判定7.1 在紫外灯下观察核酸带并判断结果。7.2 PCR后阳性对照会出现一条698bp的DNA片段.阴性对照和空白对照没有该扩增带。7.3 待测样品电泳后在相应698bp DNA位置上有带者，为阳性。进一步验证.可对序列进行测序分析(参见附录剧。7.4 元扩增带或扩增带大
9、小不是698bp的为阴性。3 SN/T 1675一2005A.1 1:臭代十六烧基二甲殷(CTAB)溶液附翠A(规范性附录)试剂配制按2%CTAB, 1. 4 mol/L NaC1, 20. 0 mrnoL/L EDTA , 20. 0 rnoL/L Tris-HCl pH 7.5配制。用前加疏基乙醇到终被度为0.25%。A.2 抽提液1三氯甲:皖叩异戊薛，将二氧甲:院和异戊醇按24: 1的比例:昆合，密闭避光保存。A.3 抽提液2盼-三氯甲烧-异戊醇.用1.0 rnol/L pH 7.9土O.2丁ns饱和过的重蒸酣:三氯Ej3烧:异戊醇按25 : 24 : 1的比例混合，密闭避光保存。A.4
10、 氯化镜(MgCI2) 25.0 mmol/L。A.5 Taq酶用10倍i农缩援冲液(10X buffer) Tris-HCl 氧化梆(KCDTritonX-100 500.0 mmol/L pH 8. 8 500. 0 mmol/L 1% A.6 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris 54.0 g 明j酸27.5g EDTA 2.9 g 加水到1 000.0 mL 用5.0mol/L的盐酸调pH到8.0，A.7 滇化乙链(EB)溶液用水配制成10.0mg/mL的浓端液。用时每10.0mL电泳液或琼脂中加1.0LA.8 i臭酣蓝指示剂溶液(6X上样援冲液)澳盼蓝100mg，加双蒸水5mL，在
11、室温下过夜.待溶解后再称取蔚糖25g，加双蒸水j容解后移入滇盼蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入氮氧化纳溶液1滴，调至蓝色。4 SN/T 1675-2005 附录B (资料性附录)RSIV扩增产物的序列GTGACTGCAC ACCAAI、GGACGTGGTCGACA AGGTGTATGT CAT白TCCAGAT50 51 GGTGGCTGTG ACTCGGATG丁GGTGTCCCCT jCGTCAIAIA CGGGCGCGIA 100 101 TGTGIATGAG CCGGTGCCCG GCGTGIACAA GA.J.CGTGAIA CCCATGGACT 150 151 丁CCAGAGTCI
12、、GTATCCGAGTAIIATCATAT CCAAGAACAT 式TGCTACAGC200 201 ACCTTGGTAG ACCAGGGCGG CGAGGAGIAT GCGTGGCAAG AGCACGAAGG 250 251 CTGCGAACAC GACCCACAGT ATGCAAAACA ACACGCCCTT GGCGTCGAGA 300 301 丁TGG丁GTCI、TGCAATGI立ACATGGCAGCGC TTCCGCGACG CGCCACCCAA 350 351 GAGCGGGCCA GGATGCGTGA GCGCAIATCA GAAATGAAGA TCCAGTACGC 400 40
13、1 AAGCATGACA CCCTCGGTGG TTAAGTGTAA CGTCTTCAGC 丁TCAGGTTCA450 451 CGCATGCTCA CGAAGGCGTG CTGCCACGGG 丁GCTGCGTAACCTGCTGGAG 500 501 AGCAGGGCCC GCGIACGAGC GCGCATCAAG ACGACAGACG ACCCCGACAT 550 551 TA.GGGCAGTT CTGGACAAGA AGCAGCTGGC GTACAAGATA AGCGCCAACT 600 601 CTGTGTf气CGGCACCATGGGC ACGCAGAGGG GCTACCTACC GT丁
14、LATGGCG650 651 GGGGCAAI、GACGACIACAIA CTGCGGCCGC AAGCTGA了TG人GAAAGCC698 D mOON!h户H在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准鱼真铜虹写在病毒聚合酶链反应操作规程SN/T 1675-2005 h 中国标准出版社出版北京复兴门外旦旦河北街16号邮政编码:100045 向址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷品6开本880X 1230 1/16 fp张O.75 字数10千字2006年1月第一版2006年1月第次印刷印数l2000!帽，只定价8.00元争夺书号:155066 2-16599 SN/丁1675叩2005
