1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1676-2005 山羊关节炎m脑炎病毒分离试验操作规程Protocol of isolation for the caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) 2005-09酬30发布中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局 2006-05-01实施中华人民共和国出入境检验检疫行业标准山羊关节炎脑炎病毒分离试验操作规程SN/T 1676-2005 号令中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷9唔开本880X
2、 1230 1/16 印张005字数8千字2006年1月第一版2006年1月第一次印刷印数1-2000专营书号，155066 2币16600定价6.00元SN/T 1676-2005 目。昂本标准主要依据国际兽疫局OIE(陆生动物诊断试验和疫商使用手册第5版(2004)的有关内容编制而成。本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验栓疫局。本标准主要起草人:陈书E昆、秦智锋、范万红、曾少灵。本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 1 范围山羊关节炎四月窗炎病毒分离试验操作规程本标准规定了山羊关节炎-脑炎病毒(CAE
3、V)的分离试验方法。本标准适用于山羊关节炎-脑炎的诊断。2 规范性引用文件SN/T 1676-2005 下列文件中的条款通过本标准的引用市成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。然阳，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SN/T 117 1. 1-2003 山羊关节炎脑炎抗体检测方法酶联免疫吸附试验3 原理将原代或传代山羊胎儿关节滑液囊膜(GSM)细胞或绵羊脉络丛(SCP)细胞(传代次数少于15代), 与怀疑惑
4、染CAEV的活动物病料，如感染关节腔的内容物、乳汁、外周血液中的自细胞共培养。动物死亡后，最容易的病毒分离方法是把感染组织(例如肺、脉络丛、滑液囊膜或乳房)进行移植培养。也可以从宰盾的肺脏中收集巨噬细胞与敏感细胞进行共培养。其特征性的细胞病变(CPE):出现树枝状、能折光的星状细胞或合胞体。CAEV的存在与否可以用免疫标记方法或电镜镜检法来进行确证。4 仪器与材料4, 1 CO2培养箱。4, 2 灭菌手术剪。4.3 元菌平血。4.4 25 crn2细胞培养瓶。4.5 元菌吸管(5rnL, 10 rnL)。4.6 培养基过滤除菌系统。5 标准毒株与试荆本标准所用化学试剂除另有特殊规定外.均为分析
5、纯a5.1 CAEV标准毒株。5.2 培养液5.2.1 抗菌素贮存液:配制见第A.l章。5.2.2 细胞生长液:配制见第A.2午。5.2.3 细胞维持液:配制见第A.3平。5.2.4 日anks平衡盐溶液(HBSS):配制见附录A.40 5.3 指示细胞SN/T 1676-2005 CAEV可在多种来游、于山羊和绵羊的细胞中生长，其中以GSM细胞或SCP细胞最为适宜。指示细胞可自行制备.或由权威机构提供。GSM细胞或SCP细胞可以从胎羊或新出生而未感染本病的羔羊制备，繁殖4代-5代后贮存于液氮中。复苏的细胞在传代10代15代之前均可用于共培养。尽管SCP细胞在传代10代15代后仍生长很好，但对
6、CAEV的敏感性降低。5.4 病料的采集5.4.1 活动物病料的采集对于疑似CAEV感染的活山羊，无茵条件下采集外周血、泌乳期的乳汁、或者关节腔的抽取液，从中制备白细胞。5.4.2 动物尸体病料的采集无菌操作收集尽可能新鲜的可疑组织样品，如肺、滑液囊膜、乳房等，放入无菌的HBSS或细胞生长液中。从肺泡冲洗物(死后气管-肺泡冲洗物)中较易制备肺泡臣噬细胞，肺泡巨噬细脂可以与GSM细胞或SCP细胞共培养.分离CAEV病毒。6 操作步黯6.1 GSM原代细胞和继代细胞培养GSM原代细胞和继代细晦培养见SN/T117 1. 1-2003的附录Ao6.2 活体样品的细胞培养6.2. 1 外周血中白细胞的
7、制备外周血可用肝素铺、乙二胶四乙酸(EDTA)或拧攘酸盐抗凝，1000 X g离心15minc吸出上层f炎黄色的白细胞于新的无菌离心管中，用HBSS重悬。400Xg离心40min，吸弃t清液。吸取界面细胞，于新的无菌离心试管中，用HBSS重悬.以100Xg离心10mino用细胞生长被重悬白细胞，制成约6X 106个细胞/mL细胞悬液。6.2.2 乳汁中白细施的制备按6.2.1方法进行离心、洗涤、重悬。6.2.3 白细胞的培养将制备的自细胞悬液置聚凹氟乙烯袋(Teflonbags)中，于37C、5%C02搜润条件下培养10d 12 d，然后把自细胞加入到洗涤过的快长成单层的指示细胞培养瓶中。6.
8、2.4 白细胞与指示细脂的共培养将快长成单层的GSM细胞或SCP细胞用细胞维持液洗两次。取10mL白细胞培养物.加入到快长成单层的GSM细胞或SCP细胞的细胞培养瓶中进行共培养。必要时进行换液和传代。培养物需连续观察5周，观察细胞是否出现CPE和特征性的细胞病变。6. 3 组织病料的移撞培养6.3. 1 元菌条件下用手术剪刀将组织病料于培养血中充分剪碎，再加入适量的HBSS或细胞生长液。6.3.2 用巴斯德吸管分别将各个碎粒转移至25c旷的细胞培养瓶中，每瓶大约2030个碎粒，于每一碎粒上小心滴加一滴细胞生长液，盖紧瓶盖。6. 3. 3 将细胞培养瓶置于37C、5%C02的湿润条件下培养。保持
9、3d4 d不动以便组织粒贴壁。6.3.4 小心地加入新鲜的细胞生长液，组织粒周围将慢慢长出新的细胞。6.3.5 当长出足够多的细胞后，用常规膜酶消化法消化，继代扩大培养。6.3.6 使细胞长至单层，连续观察5周是否有CPE形成。6. 3. 7 出现任何的可疑病毒繁殖均需要用共培养方法来进一步确证。6.3.8 共培养方法参照6.2.4方法进行。&卢6.4 蹄泡应晦细胞与指示细胞的培养6.4. 1 肺泡巨噬细胞的哥哥备肺泡臣噬细胞的制备参照6.2.1进行。6.4.2 肺起臣噬细胞与指示细胞的共培养肺泡恩噬细胞与指示细胞的共培养参照6.2.3方法进行。7 结果判定7. 1 阳性对照SN/T 1676
10、-2005 细胞病变多在培养2周4周后出现。阳性病毒对照，镜检时GSM细胞或SCP细胞出现特征性细胞病变:感染细胞高度空泡化.或者出现巨大的合胞体，或者出现树枝状、能折光的星状细胞。7.2 阳性结果7.2.1 被检样品共培养的GSM细胞或SCP细胞出现特征性细胞病变:感染细胞高度空泡化，或者出现巨大的合胞体，或者出现树枝状、能折光的星状细胞，判为阳性。7.2.2 阳性结果的需要经过其他病原学鉴定方法加以确证。且怀疑有CPE形成，应该进行飞片培养。然后固定飞片。通常采用免疫标记技术，如采用间接免疫荧光抗体技术或间接免疫酶标技术，确定病毒抗原是否存在。也可以离心收集可疑感染的细胞单层，置于电镜下观
11、察是否有慢病毒颗粒存在。如果培养液中出现了避转录酶，也说明有逆转录病毒存在。7.3 可疑结果被检样品共培养的GSM细胞或SCP细胞出现非特征性细胞病变，不能判定时，判为可疑。可疑结果需再重复一次共培养试验，然后按7.2所述的方法进行确认。7.4 被检阴性结果被检样品共培养的GSM细胞或SCP细胞镜检时没有出现细脑病变。的CON-h但HZSNjT 1676-2005 附录(规范性附录)试剂的配制A 100万IU1 g 100 mL -20C保存备用。使用时每100mL培养基中加入抗菌素贮存液抗菌素贮存液素G链霉素加灭菌双蒸水或去离子水至每瓶5mL分装于灭菌小瓶中，A.1 1 mL。细胞生长液RPMIl640营养液，100IU/mL青霉素G，100g/mL链霉素，10%羔羊血清。4C冰箱贮存。RPMIl640培养基可选用各种商品供应的粉末培养基.按生产广商提供的资料配制并除菌。A.2 细胞维持液A.3 RPMIl640营养攘，100IU/mL青毒素G，100g/mL链霉素，1%羔羊血清。Hanks平衡盐溶液(HBSS)A.4 可选用商品化的各种粉末培养基，按生产厂商提供的资料配制并除菌。4C冰箱贮存。书号:155066.2-16600 定价:6.00元SN/T 1676 2005
