1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1679-2005 动物边虫病微量补体结合试验操作规程Protocol of micro幽complementfixation test in animal anaplasmosis 2005-09-30发布段E喘黯翠式主兔数码防伪中华人民共和国国家股量监督检验检茂总局2006-05-01实施;:;nc 目可吕本标准中的附录A、附录B为规市性附录。本标准由回家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人:赖平安、谷强、吴丹、王申正。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1679
2、一2005I SN/T 1679-2005 动物边虫病微量补体结合试验操作规程1 范围本标准规定了动物边虫病微量补体结合试验的操作方法、步骤及结果判定。本标准适用于动物边虫病的血清学诊断。2 缩略i吾下列缩略i吾适用于本标准。2.1 VBS 巴比妥缓冲液(配方见f;J录A)2.2 CFT 补体结合试验3 材料与试剂3. 1 仪器与器材水浴箱、离心机、冰箱、96孔U型板、微量可谓移被器、12通道微量移液器、吸头等。3.2 试验材料各种被检功物血清的灾能温度和时间见表10表1各种被检动物血清的灭能温度和时间血清类别灭能温度/，C灭能时间/rnin学5859 30 马5859 30 驴、2累6364
3、 30 黄牛、水牛、猪5657 30 骆驼54 30 3.3 试剂3.3.1 阿氏液(见附录B)、VBS，3.3.2 边虫病补体结合抗原、阳性血清、阴性血清、洛血索和补体。由指定单位供给。3.3.3 致敏的绵羊红细施悬浮液。3.3.3.1 采血从公绵羊颈静脉元菌采血。将绵羊全血与阿氏液按2: 3的比例混匀.4C冰箱保存备用(根据需用.调整采血量和阿氏液量)。供血羊1次采血量最多不超过200mL，采血间隔不少于6周。3.3.3.2 红细胞洗涤用VBS将红细胞离心洗涤三次，每次2500 r/min，离心10min。洗涤后立即配制3%绵羊红细脂悬液或保存于4C8C冰箱备用。3.3.3.3 制备3%绵
4、羊红细胞悬浮班取巳离心洗涤的红细胞，如果细胞与液面i闯出现溶血则再离心洗涤.直至无色透明为止.吸弃上清液，用VBS稀释红细胞.使成为3%的红细胞悬浮液。3.3.3.4 致敏红细胞将3%的红细胞悬液与等量适当稀释的j容血素混合，置室温15min, 1琵合时需注意:总是将梅血素SN/T 1679-2005 加到红细胞液中。4 预备试验4. 1 系列标准比色孔制备4. 1. 1 血红素;在制备取10.0mL 3%的红细胞悬液，加到离心管中，2500 r/min离心10min，弃上清，加入蒸铺水9.7 mL，悬浮沉淀、混匀，这时红细胞完全洛解，液体应透明。加0.5mL 17%的氧化纳液海匀，使其保持等
5、渗。4. 1. 2 制备系列标准比色孔因所用抗原、血清、补体和洛血素均为无色液体.所以用VBS代替。血红素为3%的红细胞溶血蔽。4. 1. 3 标准比色孔的配制标准比色孔的配制见表20孔号1 溶血度/%。血红素/L。3%红细胞/L25 VBS/L 100 4.2 溶血素效价测定4.2.1 稀释溶血素海血素稀释见表3稀释度1 : 100 1 : 200 1 : 300 1 : 400 1 : 500 1 : 600 1 : 800 1 : 1 000 1 : 1 200 ? 10 2. 5 100 表2标准比色孔的配制3 4 D 6 20 30 40 50 5 O 7伽510 12. 5 20
6、15 I 12.5 I 100 100 100 100 表3溶血素稀释:容血素窒/mL溶血素原液O.2 1/100溶血素1.01/100溶血紊1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血素1.01/100溶血紊O.5 1/600溶血素1.07 8 9 10 11 60 70 80 90 15 17.5 20 25 10 7.5 :J 2.5 。100 100 100 100 100 生理盐水量/mL19.8 1. 0 2。3. 0 4.0 5.0 7.0 4. 5 1. 0 注:如果溶血素是加等量甘油保存，则溶血案原液所需量加倍，并相应减少生理盐水景:
7、若溶血索效价高可适当提高稀释倍数。4.2.2 测定溶血素效价溶血素效价测定见表402 SN/T 1679-2005 表4溶血素效价测定表孔号1 2 3 4 D 6 7 8 9 10 11 12 溶血索稀释倍数100 400 500 600 800 1 000 1 200 对照1对照2对照3稀释的溶血素/L25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1 : 20补体/L25 25 25 25 I 25 I 25 25 25 25 25 VBS/L 50 50 50 50 50 50 50 75 75 100 3%绵羊红细胞悬液25 25 25 25 25 25 25 25 ?昆匀
8、.室温30mn, 1 000 r/ rnn离心10rnn，与标准溶血孔对比判定结果。结果(例)一t-+也L.L _J_ 一!一i一i 吁1广_j广+一1广十十十十Jl-Ll-Li 吁t-注:对照1: 为1: 100溶血素对照。对照2:为补体对照。对照、3:为红细胞对照。十十十:100%不浴血。份:75%不熔血。, , :50%不溶血。十:25%不溶血。:100%溶血。以出现50%溶血的溶血萦最高稀释倍数为一个路血单位.如第7孔，:容血素的稀释倍数为1: 800。正式试验时溶血素用2个单位，即800.;.-2 = 400，因此正式试验时.洛血索作1: 400稀释。4.3 补体效价测定4.3.1
9、试验当天开启补体，解蹄，若是冻干的补体需加定量的旗锢水复原，若为新鲜露在1血清，则直接稀释。4.3.2 用VBS先将补体作1: 50稀释.按表5测定补体效价(根据补体效价可适当改变其稀释度)。表5补体效价测定10 |丁|斗lil-1年4-离-i-5一o-om-lF14-7-wD-5一m一-叩FrJ1自-?自llllliiiiLllll-llllLnu|1111一一一nu-一一nu-w-m1品-wlo-5-oH一町，、。，-mD一Dr一i;i-m AU一UT温一室一-匀一目比atm 3 -l寸il1寸!11寸il-4TIl-35 40 孔号1 : 50补体/LVBS/I-L 致敏红细胞/L2 -
10、7-i?ii寸|142!ll一6 ，均/ 万UHWU 4吨dv |-4!il|75 15 30 65 60 45 40 35 50 50 50 50 50 50 结果一1IJ钊阶注:十十十十:100%不溶血。+十十:75%不溶血。:50%不溶血。:25%不溶血c:100%溶血。以引起50%溶血的最小补体量为一个单位，正式试验使用4个单位。上述结果的一个补体单位为20L，按式(1)计算:x = _!_一4X . ( 1 ) 式中:X一一配制4个单位补体所需补体原攘的稀释倍数;3 SN/T 1679-2005 一一一滴定时补体稀释倍数;卢一测出的1个单位补体用量;一一正式试验时每孔补体用罩。计算结
11、果:X=15.6，即补体作1: 15.6倍稀释，25L体积中含有4个补体单位。4.4 抗原效价的9!U定4.4.1 将抗原和阳性血清分别作2倍系列稀释。4.4.2 方阵试验补体、溶血素按前面试验的结果稀释。抗原效价测定见表60表6抗原效价测定表孔号1 2 3 4 5 6 7 8 抗原稀释倍数1 : 5 1 : 10 1 : 20 1 : 40 1 : 80 1 : 160 1 : 320 对照抗原量/L25 25 25 25 25 25 25 1 : 5 A 25 25 25 25 25 25 25 25 1 : 10 B 25 25 25 25 25 25 25 25 阳性血C 25 25
12、25 25 25 25 25 1 : 20 25 清稀释1 : 40 p 25 25 25 25 25 25 25 25 1 : 80 E 25 25 25 25 25 25 25 25 阴性血清/LF 25 25 25 25 25 25 25 25 4单位补体/L25 25 25 25 25 25 25 25 ?昆匀，室温L5h致敏红细胞/11L50 50 50 50 50 50 50 50 混匀，室温1h 1 000 r/min离心10min，与配制的标准溶血孔对比判定结果，结果如表70表7抗原效价测定示例表孔号2 3 8 抗原稀释倍数1 : 5 1 : 10 1 : 20 1 : 40
13、1 : 80 1 : 160 1 1: 320 对照1 : 5 A 十十十+十十十十+十十|十十十十一-L-L+十十十一-1:101 B 1+川|二十i个十叫:十二十十+十十血释性稀阳清1 : 201 C 十十十十十十十十十十十+1十十十+但L民币L一1 : 401 D 十十十十1+忖十i十十朴?十十十一十_J_ 1 : 801 立|十十十十|十十十十|十十十十!十十十十 1 : 5阴性血清F 七十十十:100%不溶血。:75%不溶血。:50%不溶血。:25%不溶血。: 100%溶血。41 41 注寸，十4 SN/T 1679-2005 从表7看出，1: 40稀释的抗原为与阳性血清各稀释度发生
14、抑制溶血最强(十十十十)的最高抗原稀释度，因此抗原效价为1: 40。在正式试验时，使用2单位抗原单位，即作1: 20稀释。5 正式试验5. 1 试剂预稀释i容血索、抗原、补体按测定的结果稀释。对被检血清和阴、阳性对照按检疫条款要求进行稀释，按表1要求灭活。5.2 建立对照建立补体、抗原、红细胞和阴、阳性血清对照，阴、阻性血清对照和待检血清按相关检疫条款进行(见表8)。表8正式试验表子L号l 2 3 4 阳性血清对照阴性血清对照抗原对照补本对照对应血清/flL 25 25 2单位抗原/L25 25 25 4单位补体/L25 25 25 VBS/ flL 50 50 混匀，室混1.5h致敏红细胞/
15、L50 50 50 50 i昆匀，室温1h , l 000 r/min离心10min.判定结果5.3 结果判定在对照成立的前提下，与配制的标准榕血孔对照判定结果。各对照孔结果Jj)z为:一补体对照:100%溶血;一一抗原对照:100%不溶血;红细胞对照:100%不溶血;阳性血清对照:100%不语血;性血清对照:100%:容血。若被检血清i容血度大于50%，则为阴性;洛血度低于或等于50%，则为阳性。U 6 待检血清25 25 25 75 50 50 5 SN/T 1679-2005 以下所用试剂均为分析纯以上。A.1 VBS 3，5-二乙基巴比妥酸5，5-二乙基巴比妥铀氧化铀6水氧化镜氯化钙蒸
16、馆水A.2 方法附录A(规范性附录)曰比妥铀缓;中液(VBS)的配制5.75 g 3.75 g 85.00 g 1. 68 g 0.28 g 2 000 mL 首先将巴比妥酸溶解到500mL热的蒸馆水中.加入巴比妥铀和氧化铀，然后加水至2000 mL氓匀。加氧化镜和氧化钙，121C灭菌20min, pH值应为7.2，将其按每瓶100mL分装店于4C8C件下保存。A.3 用法用前将所配液体用蒸铺水作1: 5稀释。6 SN/T 1679-2005 附录B(规范性附录)阿氏琅(AIsever s)的配制以下所用试剂均为分析纯以上。B.1 A渣氧化铀4.18 g 无水拧攘酸铀8.00 g 将上述试剂溶
17、于蒸锚水中，最后稀释至900mL。B.2 B液右旋葡萄糖18. 66 g 加蒸悟水溶解，最后稀释至100mL。B.3 陶氏液(AIsevers)的制备将A和B被分装，1210C灭菌15rnin。将A和B液混合元商条件下分装到三角瓶中，密封。一般按每瓶60rnL分装，以备采血。用法:采血时，60 rnL阿氏搜加40rnL血。的OON-mhu户HZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准动物边虫病微量补体结合试验操作规程S:-J/1679一2005+ 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:1000-5网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数15千字2006年1月第一版2006年1月第一次印刷印数1-2000 定价8.00元书号:155066 2币16603SN/T 1679一2005
