1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2245-2009 化学晶体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验Chemicals-In vitro skin corrosion-Human skin model test 2009-02-20发布2009-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准化学晶体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验SN/T 2245-2009 兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴开本880X12301/16 印张O.5 字数10千
2、字2009年5月第一版2009年5月第一次印刷印数1-2000兴书号155066.2-19744定价14.00元SN/T 2245-2009 目Ij1=1 本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试方法No.431 (2004年04月刊体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验(英文版)。本标准在标准文本格式上按GB/Tl. 1-2000做了下列编辑性修改:增加了范围部分;将OECD化学品测试方法No.431中有关方法的介绍、目的、范围等改为本标准的引言;本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出井归口。本标准负责起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准参与起
3、草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、常州进出口工业及消费品安全检测中心。本标准主要起草人:刘君峰、张少岩、下学东、江红星、陈小卫、寇海娟、孙洪生。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 2245-2009 百|皮肤腐蚀是指皮肤在接触化学物质后产生的不可逆的皮肤组织损伤(如GHS中的定义)。本标准提供了一种元需活体动物试验而对化学物质腐蚀性进行评估的试验方法。评估腐蚀性通常需要进行实验室动物试验。GB/T21604-2008考虑到试验中动物的痛苦和疼痛，在其附录中允许使用体外方法进行皮肤腐蚀性的测定，以避免动物的痛苦和疼痛。完全代替GB
4、/T21604-2008的主要困难是缺少正式的、独立的、科学的体外试验方法。前验证研究可作为制定一种体内试验替代方法的第一步，随着这种研究的进行，已经开展了体外皮肤腐蚀性试验方法的验证试验研究。这些研究导致了本试验和经皮电阻试验的产生。研究表明采用人体皮肤模型的试验可以很好的区别己知的皮肤腐蚀性和皮肤非腐蚀性，而且还可提供一些有关严重腐蚀性和轻微腐蚀性之间区别的信息。本标准可以对腐蚀性化合物和混合物加以鉴定。如果结合其他已有的信息，(如pH，结构活性关系，人类和(或)动物数据)通过证据权重分析，本标准还可以对非腐蚀性的化合物和混合物加以鉴定。本标准通常不能提供受试物皮肤剌激的信息，也不能对腐蚀
5、性物质按照GHS规则进一步加以分类。为了全面评估皮肤在经皮一次染毒后的局部反应，建议按照GB/T21604-2008中的序贯试验策略或GHS中提供的相关方法进行试验。H 1 范围化学晶体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验本标准规定了化学晶体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验的原理、试验方法和程序。本标准适用于化学晶体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验。2 规范性引用文件SN/T 2245-2009 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引
6、用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 21604-2008 化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法3 术语与定义以下术语和定义适用于本标准。3.1 体外皮肤腐蚀skin corrosion in vitro 皮肤接触化学物质4h后产生的不可逆的体外皮肤损伤，即表皮和真皮的可见性坏瘟。腐蚀作用的特征有溃房、出血以及结捕，14d后皮肤因为发烫而变色，局部斑秃并结疤。应用组织病理学方法评价可疑的损伤。3.2 细胞活性cell viability 对细胞总活性(如细胞的线粒体脱氢酶还原MTT的能力)测量的参数，其取决于测量的端点和试验的设计以及细胞的数量和活性。4 原理受试物作用于一个三维的人体皮肤
7、模型，所用皮肤模型至少包含一个具有角质层功能的改造上皮。根据在特定作用时间内，细胞活性(如通过MTT还原法测定)降低到特定的临界植，来识别腐蚀性化学物质。人体皮肤模型试验的原理是建立在假设腐蚀性化学物质能够通过扩散作用或腐蚀作用穿透角质层，对其下面的细胞层产生细胞毒素作用的基础上。5 试验方法5.1 人体皮肤模型5.1.1 人体的皮肤模型可以自己建立或者通过商业途径获得(如EpiDerm和EPISKINTM模型)或实验室制备。使用人体皮肤模型必须满足本国和国际上伦理道德的要求。5.1.2 任何新的皮肤模型必须得到合法的认证(至少如5.3描述)。本试验所用的人体皮肤模型需满足5.2和5.3中的条
8、件。5.2 一般皮肤模型的条件5.2.1 应使用人体的角化细胞建造皮肤模型的上皮。功能性的角质层下面铺上多层上皮细胞，皮肤模1 SN/T 2245-2009 型可以具有一个基质层。多层角质层侧面添加必需的脂质，以防止毒素分子的快速渗透。5.2.2 皮肤模型的围堵结构可以阻止角质层周围的物质进入到下面的活性组织中。5.2.3 理想皮肤模型其角质层周围应不存在受试物进入活性组织的通道。皮肤模型应避免细菌(包括支原体)和真菌的污染。5.3 功能性皮肤模型的条件5.3.1 细胞活性可用MTT法或其他代谢有关的染色法来量化。该试验中，从阴性对照组的皮肤组织萃取或榕解的染料的光密度植(OD)至少是单独萃取
9、榕剂的20倍。在整个染毒期内，阴性对照的皮肤组织可以稳定存在培养基中(细胞活性保持恒定)。角质层应能完全阻止某些细胞毒素分子的快速渗透(如l%TritonX-100)。此性能可以用细胞活性减半的暴露时间(ETso)来评估(如EpiDerm和EPISKINTM模型，所需时间应大于2h)。5.3.2 该皮肤组织应适合在一定时间内在实验室再生，并且当该皮肤组织用于试验时，其必须能够检测出表A.1中列出化学物质的腐蚀性。6 试验步骤6.1 染毒6.1.1 每个处理组(包括对照组)使用两个相同的皮肤组织。对于液体受试物，皮肤表面应均匀覆盖足够多的受试物，最小量为25L/cmz。6.1.2 对于固体受试物
10、，皮肤表面应覆盖足够多的受试物。试验中，应用去离子水或蒸榴水润湿固体受试物，再将其均匀覆盖到皮肤上，以保证固体受试物与皮肤接触充分。如果条件允许，固体受试物应碾成粉末后使用。染毒的方式应适合于该受试物。试验最后阶段，要小心地用合适的缓冲液或0.9%NaCl榕液将受试物从皮肤表面洗去。6.1.3 试验中需同时有阳性对照试验和阴性对照试验，以确保试验模型的正常运行。推荐用的阳性对照物是冰醋酸或8mol/L KOH，阴性对照物是0.9%NaCl榕液或水。6.2 细胞活性的检测6.2.1 只有定量有效的检测方法才能被用于测量细胞活性，而且检测方法要与三维组织结构相一致。非特异性染料的结合不能干扰细胞活
11、性的检测。6.2.2 蛋白结合染料和那些不能经受住新陈代谢转变的染料(如中性红)是不适用的。最常用的方法就是MTT3-(4，5二甲基2-y1)-2，5联苯四略，唾瞠基蓝;CAS No. 298-93-1J还原法。MTT还原法的结果精确并具有可重复性，也可以用其他方法。6.2.3 将皮肤样品置于适当浓度(如O.3 mg/mLl mg/mL)的MTT恪液中，在适当温度下培养3h 后，用榕剂(异丙酬)萃取蓝色还原产物，在波长540日m595日m范围内测定还原物的OD植。6.2.4 如果受试物没有通过清洗而从皮肤上完全除去，则受试物与染料发生的化学作用可能会模拟细胞新陈代谢的情形，进而导致对细胞活性错
12、误的判断。6.2.5 如果受试物直接作用于染料，则需要增加一个额外的对照组来检测井纠正受试物对细胞活性检测的干扰。7 数据与报告7.1 数据每个组织的所得数据都要制成表格，包括:OD植、计算得到的细胞活性(百分比数植)、阳性对照组和阴性对照组的数植，以及平行试验的数据(如果有)，平均植和单个数植。7.2 报告2 试验报告内容应包括。1) 受试物和对照组:化学名称(如IUPAC名称，CAS名称)和CAS号(如己知); 化学物质或制剂的纯度和组成(质量分数); 物理化学性质(如自然存在状态、pH、稳定性、水榕性及相关研究); 试验开始前，对受试物和对照物的适当处理(如加热，研磨等); 稳定性(如己
13、知)。2) 说明所用皮肤模型的理由。3) 试验条件:所用的细胞体系;对检测细胞活性的仪器(如分光光度计)进行校准的信息;关于试验所用皮肤模型的全部支持信息(包括其有效性); 试验步骤的细节;使用的染毒剂量;对试验步骤做任何修正的描述;皮肤模型的历史数据的参考资料;评价标准的描述。的结果:每个试验样本的数据表格;描述其他观察的结果。5) 结果的讨论。的结论。7.3 结果解释SN/T 2245-2009 每一个试验样本得到一个OD植，用该植和阴性对照相比得出的百分比来表示细胞相对活性(阴性对照组的细胞相对活性一般视为100%)。用区别腐蚀性物质和非腐蚀性物质(或区别不同的腐蚀度等级)的细胞活性的临
14、界百分率或统计程序来评估结果和识别腐蚀性物质时，结果应该明确并做好记录。通常情况下，这些临界直是在最佳试验条件下，即在将获得批准的试验中获得的，并且得到了合理性研究的确认，例如，以下就是一个对与EpiDerm模型相关的腐蚀性的预测。a) 以下情况说明受试物对皮肤是有腐蚀性的:染毒3min后细胞活性不足50%; 染毒3min后细胞活性大于或等于50%，但1h后小于15%。b) 以下情况说明受试物对皮肤没有腐蚀性:染毒3mi日后细胞活性大于或等于50%，并且1h后大于或等于15%。白CON-m寸NNH军SN/T 2245-2009 附录(资料性附录)推荐的化学物质A 推荐的化学物质见表A.l。A.
15、l 推荐的化学物质1，2二氨基丙烧CS No. 78-90-0 严重腐蚀丙烯酸CS No. 79-10-7 严重腐蚀2叔丁基盼CS No. 88-18-6 腐蚀氢氧化饵(10%)CS No. 1310-58-3 腐蚀硫酸(10%)CS No. 7664-93-9 腐蚀辛酸CS No. 124-07-02 腐蚀4氨基1，2，4三瞠CS No. 5847-13-4 元腐蚀丁子香盼CS No. 97-53-0 元腐蚀苯乙基1臭CS No. 103-63-9 元腐蚀四氯乙烯CS No.127-18-4 元腐蚀异十八(烧)酸CS No. 30399-9084-9 元腐蚀4-(甲硫基)苯甲自主CS No. 3446-89-7 元腐蚀表A.lA.2 表A.l中所列的大部分化合物来源于为了ECVAM国际一致性研究而设计的化合物列表。化合物的选择是基于以下标准:相同数目的腐蚀性物质和非腐蚀性物质;涵盖大多数化学品种类，并且商业可获得的化学物质;包含了严重腐蚀性和轻微腐蚀性的化合物，以保证对腐蚀性能加以区别;所选的化合物除了具有腐蚀性外，可在实验室里正常使用，没有其他危害。a) 飞、B/Jhu c) d) 书号:155066.2-19744定价:14.00元SN/T 2245-2009
