1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2344-2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Quarantine identification of cucumber green mottle mosaic virus 2009-07-07发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法SN/T 2344-2009 兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴开本880X12301/16 印张O.75
2、字数17千字2009年10月第一版2009年10月第一次印刷印数1-2000兴书号155066.2-19950定价16.00元标准分享网免费下载SN/T 2344-2009 目Ij1=1 本标准的附录B、附录C为规范性附录，附录A、附录D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广西出入境检验检疫局。本标准主要起草人:陈青、邓丛良、张永江、廖富荣、林石明、陈红运、王宏毅、李伟丰、李树庆。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 2344-
3、2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能带有黄瓜绿斑驳花叶病毒的葫芦科作物的种子和苗木的检疫鉴定。2 原理2.1 黄瓜绿斑驳花叶病毒学名与分类地位学名:Cucumber green mottle mosaic virus 缩写:CGMMV分类地位:烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员2.2 血清学特性CGMMV具有很强的免疫原性。2.3 粒体形态黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体为直杆状，长度为300日m，宽为18nm。2.4 基因组病毒基因组为正单链RNA，全长约6.4kb，编码4个蛋白;病毒基因组5和3端分别含有一
4、段非编码区。该病毒奇主范围广泛、危害严重，相关资料参见附录A。3 主要仪器设备与试剂3.1 主要仪器设备和用具微量研磨仪;透射电子显微镜;酶标仪;洗板机;微量天平(感量:0.001g); PCR仪;电泳仪;水平电泳槽;凝胶成像仪;高速冷冻台式离心机;水洛槽;pH t十;各种量程的可调移液器(1000L、200fJ-L、20L、2fJ-L); 各种吸头(1000fJ-L、200fJ-L、20L、2L);96孔酶标板;离心管(1.5 mL、0.6mL、0.2mL)。3.2 主要试剂主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。标准分享网免费下载1 SN/T 2344-2009 4 检测样晶的制备4.1 种子样
5、晶制备及检疫鉴定挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号，采集的叶片分成3份，根据需要分别用于酶联测定免疫和分子生物学检测及电子显微镜观察。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。4.2 苗木检验鉴定有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同4.L 4.3 植物产品的检验鉴定植物产品有症状的部分(如:果实上的畸形、斑驳等)单独检测。没有症状或元法观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。5 检测与鉴定5.1 双抗体夹心酶联免
6、疫暇附测定把击l备的样品上清液加入己包被CGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品一致。具体操作见附录B。5.2 RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。设阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。5.3 免疫电子显微镜观察具体操作参见附录D。6 结果判定与记录第5章检测与鉴定中如果2种方法检测为结果为阳性，即可判断该批种苗携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。酶联测定为阳性后，
7、RT-PCR检测为阳性即可判断为携带有黄瓜绿斑驳花叶病毒。必要时可进行生物接种试验，并进行复验。7 结果记录与样晶保存7.1 结果记录完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经于人和实验人员的签字。电镜观察需有病毒粒体照片;酶联测定需有酶联板反应的照片和原始数据;PCR检测需有电泳结果照片。7.2 样晶保存2 鉴于黄瓜绿斑驳花叶病毒为检疫性有害生物，病毒要有活体样品存在，其他实验样品应妥善保存于80 C冰箱中。SN/T 2344-2009 附录A(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒相关资料A.l 寄主范围黄瓜绿斑驳花叶病毒在自然界主要侵染西瓜CCitrul
8、lus lanatus)、甜瓜Ccucumismelo)、黄瓜CCucumis sati vus )、南瓜CCucurb山moschata)、辄子CIagenariasiceraria)、丝瓜CLuffa cylindrica)、苦瓜CMomordica charatia)等葫芦科植物。一些杂草也是CGMMV的奇主:北美克CAmaranthusbli toide仆，反枝克CAmarathusretroflexu仆，天芥菜CHeliotro户lumeuro户aeum)，马齿克CPortulacaoler acea) ，龙葵CSolanumnigrum)。A.2 病害症状黄瓜:叶片斑驳井凸起，畸形
9、，植株矮化，果实上可产生黄或银色条斑，果实严重受损。西瓜:受侵染叶片轻型叶斑驳，严重时出现宿斑，植株矮化，成熟期果实表面出现浓绿色圆斑，果肉变色和腐烂。甜瓜:茎端新叶出现黄斑，随叶片老化症状减轻。辄子:叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化，叶脉呈绿带状。A.3 分布地区CGMMV于1935年在英国的黄瓜上被发现和报道，目前在英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、印度、沙特阿拉伯、丹麦、德国、俄罗斯、保加利亚、捷克、巴西、爱尔兰、摩尔多瓦、瑞典、芬兰、韩国、朝鲜、以色列、波兰、日本、巴基斯坦和我国大陆、台湾均有分布。A.4 传播途径CGMMV可以通过接触传播，也可以通过种子传播，西瓜常通过带毒的础木辄子而
10、感染，常见瓜类病毒的传播介体甥虫不能传播CGMMV，嫁接等农事操作也是田间病害流行的主要因素。植株一旦发病，如果未进行杀灭处理，土壤也可带毒，带毒土壤也可以成为病害发生的侵染源。3 标准分享网免费下载SN/T 2344-2009 附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫暇附测定B. 1 试材B. 1. 1 包被抗体特异性的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体。B. 1.2 酶标抗体碱性磷酸醋酶标记的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体。B. 1.3 底物对硝基苯磷酸二号内CpNPP)B. 1.4 样晶抽提缓冲液CpH7.4)PBST 1 L 亚硫酸铀CNaZS03)l. 3g PVPCMW24 00040 000) 20
11、g 叠氮化铀CNaN3)0.2 g 4 C储存。B. 1.5 包被缓冲液CpH9.6)碳酸铀CNaZC03)碳酸氢铀CNaHC03)l. 59 g 2.93 g 叠氮化专内CNaN3)0.2 g 加入蒸榴水900mL水榕解，用盐酸调节pH直到9.6，然后加蒸榴水至1L , 4 C储存。B. 1.6 PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4)氧化铀CNaCl)8.0 g 磷酸氢二号内CNazHP04)l. 15g 磷酸二氢锦CKHzP04)0.2g 氧化锦(KCl)0.2 g 吐温200.5 mL 加入蒸榴水900mL水恪解，用NaOH或HCl调节pH直到7.4，然后加蒸榴水至1L。每升PBS中加入
12、0.5mL的Tween20。B. 1.7 酶标抗体稀释缓冲液CpH7.4)PBST 1 L BSAC牛血清白蛋白)或脱脂奶粉2.0 g PVP(MW24 00040 000) 20.0 g 叠氮化专内CNaN3)0.2 g 4 C储存。B. 1.8 底物CpNPP)缓冲液CpH9.8)氧化镜CMgClz)0.1 g 叠氮化专内CNaN3)0.2 g 二乙醇胶97 mL 榕于800mL蒸榴水中，用盐酸调pH直至9.8，蒸榴水定容至1L , 4 C储存。4 SN/T 2344-2009 B. 2 程序B. 2.1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100L/孔，加盖，室温孵育
13、4h或4C冰箱孵育过夜，请空酶联板孔中榕液，PBST洗涤4次6次。B. 2. 2 样晶制备待测样品按1: 10(重量:体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/mi日，离心10mi日，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B. 2. 3 加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100L/孔，加盖，室温孵育2h或4C冰箱孵育过夜，请空酶联板孔中榕液，PBST洗涤4次6次。B. 2. 4 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，井加入到酶联板中，100fJ-止止L;乓4矿/吁/室温孵育2h，清空酶联板孔中榕液，PBS丁T洗涤
14、4次6次。B. 2. 5 加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mLC现配现用)，按100fJ-L/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B. 2. 6 读数酶联仪在405日m处读OD植。B. 3 结果判断B. 3.1 对照孔的OD405植(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，&P:缓冲液孔和阴性对照孔的OD405植2;孔的重复性基本一致。B. 3. 2 在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下:样品。D405植/阴性对照OD405植2，判为阳性。样品。D405植/阴性对照OD40s1直在阔植附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法验证。样品。
15、D405植/阴性对照OD405植2，判为阴性。B. 3. 3 若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。标准分享网免费下载5 SN/T 2344-2009 C.1 试剂C.1.1 RNA提取试剂附录C(规范性附录)RT-PCR检测TrizoL裂解液、三氯甲皖、异丙醇、75%乙醇。C. 1.2 反转录试剂M-MLV RT(200 U/fJ-L)、5XRT缓冲液、dNTPClOmmol/L)、RNasin(40U/fJ-L)、DEPC处理过的ddHzO。C. 1.3 PCR试剂10XPCR缓冲液、氧化镜(25mmol/L)、dNTPClOmmol/L)、Taq酶(5U/L)。C. 1.4
16、电泳试剂C. 1.4. 1 50 X TAE Tris 242 g 冰乙酸52.1 mL NazEDTA 2HzO 37.2 g 加水至1L。用时加水稀释至1XTAE，C.1.4.2 6X加样缓冲液0.25%澳酣蓝40% (质量浓度)蔚糖水搭液C.2 实验步骤C. 2.1 总RNA提取称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的l.5 mL离心管中，加入1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置3min;4 c , 12 OOOg离心10mi口，取上清液;加入200fJ-L三氯甲烧，上下颠倒混匀，室温静止3min;4 c , 12 OOOg离心10mi口，取上层水相;加等体
17、积的异丙醇，颠倒混匀;4c , 12 OOOg离心10mi日，弃上清液;加1mL 75%的乙醇洗涤沉淀，4c , 7 500g离心5r丑1日，弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后，恪于30fJ-L经DEPC(焦碳酸二乙醋)处理的ddHzO，-20 C保存备用。C. 2. 2 RT-PCR反应C. 2. 2.1 51物序列上游引物CGMMV1: 5 -CgTggT AAgCggCATTCT AAACCTC-3 下游引物CGMMV2:5 -CCgCAAACCAA TgAgCAAACCg-3 RT-PCR产物大小654bp。C. 2. 2. 2 cDNA合成反转录总体系为12.5fJ-L。在PCR管中依次
18、加入3L总RNA，lfJ- L CGMMV2引物，在65C温洛7mi口，然后，冰洛5min，瞬离，再向PCR管中加入下列试剂:M-MLVRT(200 U/fJ-L) O. 5L、5XRT缓冲液2.5fJ-L、dNTP(10 mmol/L) O. 5 fJ-L、RNasi日(40U/fJ- L)O. 5 fJ-L、DEPC处理的ddHzO4.5 fJ-L。反应参数:37C 60 min , 95 C 10 min，合成的cDNA于20 C冰箱保存备用。C. 2. 2. 3 PCR 扩t曾PCR反应体系见表C.1。反应参数:95C 4 min;95 C 60 s , 60 C 50 s , 72
19、C 60 s，30个循环;6 72 C 10 mill，也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。试齐。名称10XPCR缓冲液氯化模(25mmol/L) dNTPOO mmol/L) CGMMVl(20 pmol/L) CGMMV2(20 pmol/L) C. 2. 3 琼脂糖电泳C. 2. 3.1 制备;疑胶Tq酶(5U IfJ-L) cDN模板ddH20 表C.lPCR反应体系SN/T 2344-2009 加样量/L2. 5 2. 5 1. 0 O. 5 O. 5 0.2 3. 0 补足反应总体积至25fJ- L 将1XTAE和电泳级琼脂糖按l.o%(质量浓度)自己好，在微波炉中熔化混匀，
20、冷却至55C左右。C.2.3.2 加滇化乙链(EB)加入漠化乙链浓度为o.5g/mL，混匀，倒入己封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的TAE(缓冲液没过凝胶表面约1mm)。C.2.3.3 加中羊用适量(约2fJ-L3L)的6X加样缓冲液与8L样品混合，然后将其和适合的DNA分子量标准物分别加入到琼脂糖凝胶孔中。C.2.3.4 电泳接通电源使DNA向阳极移动。当加样缓冲液中的澳酣蓝迁移至足够分离DNA片段时，关闭电源。将整个胶置于紫外透射仪上观察。C. 2. 4 结果判断阳性对照在654bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照元特异性扩增，如果
21、样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性;如果样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。标准分享网免费下载白CON-寸寸的NH军SN/T 2344-2009 附录(资料性附录)免疫电子显微镜观察D 试剂0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)。5 mmol/L DIECA(二乙基二硫代氨基甲酸号内，也称铜试剂)。0.5% PEG 6000。D.1 D.1.1 D.1.2 D.1.3 实验步骤D. 2. 1 Formvar膜制f乍将聚乙烯醇缩甲醒(Formvar)恪于三氯甲烧，配成0.2%0.3%搭液，贮于冰箱内备用。制膜时取一块干净的玻璃片插入榕液中，取出倾斜待榕液挥发，
22、用锋利的刀片沿玻璃边划痕，再将玻璃片以450缓慢插入蒸榴水中，使薄膜从玻片上脱落下来漂浮于水面，将新的、规格为230目的铜网小心摆上，再用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养皿中干燥备用。D. 2. 2 电镜样晶制备D. 2. 2.1 样晶的制备取幼嫩的病叶10mg，加20mg左右的金刚砂，和0.05mol/L的PB缓冲液(含5mmol/L二硫苏糖醇或自琉基乙醇，5mmol/L DIECA , O. 5%PEG 6 000，调pH7.0)0. 32 mL充分研磨，37C孵育2h 后，室温6000g离心2min，上清液留作电镜制片用。D. 2. 2. 2 诱捕将一滴1: 200稀释的CGMMV抗血清置于石蜡板上，用表面覆盖有Formvar膜的铜网放在上面室温孵育10min后，用滤纸将铜网吸干，蒸榴水洗铜网，再吸干。然后放在制备好的样品上分别孵育15 r丑1日、20min、60min，同时用未经抗血清孵育的铜网作对照。用滤纸将铜网吸干，蒸榴水洗铜网，再D.2 吸干。D. 2. 2. 3 负染用1%2%磷鸽酸负染2min3 min，晾干后即可在透射电镜下观察。结果判断和未经抗血清孵育的铜网相比，诱捕的铜网在相同的视野下，观察到数量较多的长度为300日1丑，宽为18日m的直杆状病毒粒体，则结果是阳性。D.3 书号:155066.2-19950定价:16.00元SN/T 2344-2009
