1、ICS 65120B 46N Y中华人民共和国农业行业标准农业部1063号公告一32008动物尿液中1 1种13一受体激动剂的检测液相色谱一串联质谱法Determination of B-receptor agonists in animal urineLiquid chromatography-tandem mass spectrometry20080715发布 20080715实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部1 063号公告一32008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料T业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：上海市兽药饲料检
2、测所、浙江省饲料监察所、北京市饲料监察所。本标准主要起草人：黄士新、王蓓、曹莹、李丹妮、严凤、张文刚、朱聪英、蒋音、应永飞、孙志文。农业部1063号公告一32008动物尿液中11种p一受体激动剂的检测液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了动物尿液中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗等11种B受体激动剂的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于动物尿液中克仑特罗等11种口受体激动剂的测定。方法检测限为01 ngmL，定量限为02 ngmI。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用
3、文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理样品经氢氧化钠溶液调节pH，叔丁醇、叔丁基甲醚混合溶液萃取并浓缩后用固相萃取小柱净化，洗脱液浓缩后用含02甲酸的水溶液溶解，供液相色谱一串联质谱仪进行检测，内标法定量。4试剂和材料除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GBT 6682中一级水的规定。4 1甲醇：色谱纯。4 2甲酸：色谱纯。4 3氢氧化钠。44叔丁醇。4 5叔丁基甲醚。4 6氨水。4 7
4、叔丁醇一叔丁基甲醚(60：40)提取液：取叔丁醇60 mL，叔丁基甲醚40 mL混匀。4 8氢氧化钠溶液(5 toolI。)：称取氢氧化钠109，溶于50 mL水中。4 9 02甲酸水溶液：取甲酸1 mL，加水定容至500 mL。410 5氨水甲醇溶液：取5 mL氨水与95 mI，甲醇混合。4 11克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗对照品：纯度95。4 12 B一受体激动剂贮备液配制：分别精密称取11种口受体激动剂类药物对照品，用甲醇配成浓度各约为l mgmL的标准贮备液，2。C8冷藏保存，有效期6个月。413混合对照
5、品工作液：分别吸取11种0受体激动剂贮备液，置于一棕色容量瓶中，用02甲酸水溶液稀释成浓度为1“gmL的对照品工作液。20c8冷藏保存，有效期1个月。4 14同位素内标：克仑特罗D9、沙丁胺醇一D3、莱克多巴胺一D5，纯度92。农业部1 063号公告一320084 15同位素内标贮备液：分别取三种同位素内标，用甲醇配成三份浓度各约为100”gmL的贮备液。4 16同位素内标工作液：将上述同位素内标贮备液用02甲酸水溶液稀释成40 ngmI。的混合工作液。4 17固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱，1 mL30mg，或其他性能类似的小柱。4 18氮气：纯度9999。5仪器和设备5 1液相色谱一串联
6、质谱仪：配有电喷雾电离源。52旋转蒸发仪。5 3离心机：转速大于7 000rmin。5 4旋涡振荡器。5 5滤膜：022*m，水系。5 6天平：感量00001 g。57微量移液器：100 gL。6试样制备供试样品置于18以下冷冻保存，使用前放至室温，如有混浊，离心后取上清液备用。7操作方法7 1提取取备用液(6)50 mL于50 mL离心管中，添加内标工作液100 ML(416)，充分混匀。用5 molL氢氧化钠溶液(48)调节pH至910，加提取液(47)10mL充分振荡，7 000 r!rain离心10min，将上清液转移至梨形瓶中，重复提取一次，合并上清液，旋转蒸发(40。C)至干。用0
7、2 oA甲酸水溶液(49)10 m嘴解残余物，备用。7 2净化固相萃取小柱先用1 mL甲醇，1 mL水活化。备用液(72)过柱，用1 mL02甲酸水溶液(49)和1mL甲醇淋洗，空气抽干2min，用5氨水甲醇溶液(410)3mL洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发(50。c)至干，用1o mL02甲酸水溶液(49)溶解，经022 t*m滤膜过滤后进样测定。8液相色谱一串联质谱测定8 1液相色谱条件a)色谱柱：C18 100 mmX 21 mm，粒径17xm。或其他效果等同的C。s柱。b)柱温：40。c)进样量：5“L。d)流动相：甲醇：02甲酸溶液一50：50。c)流速：02 mLmin。82质谱条件a
8、)离子源：电喷雾正离子源。b)检测方式：多反应监测。c)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。2农业部1 063号公告一32008d)毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度。e)定性离子对、定量离子对及对应的保留时间、锥孔电压和碰撞能量见表1。表1 11种13一受体激动剂及三种内标的定性、定量离子对及保留时间、锥孔电压、碰撞电压的参考值定性离子对 定量离子对 保留时间 锥孔电压 碰撞能量被测物名称V eV西马特罗 21982020 1021981597 124 16(Cimater01) 219K159 7 16
9、马布特罗 310 82236 9 163108：2369178 26(Mabuter01) 31082169 25西布特罗 23382159 7 1623381597126 23(CimbuteroI) 23382159 10溴布特罗 3667：292 7 193667：2927 172 25(Brombuter01) 3667：3488 12莱克多巴胺 30191638 17301921638 132 26(Ractopamlne) 30191207 22氯丙那林 213 91 53 8 1721391538 1 58 25(Clorprenaline) 21391959 12特布他林 22
10、5 821518 17225 8151 8 124 25(Terbutaline) 22581247 21齐帕特罗 261 8243 8 1326181847 1 25 24(Zilpater01) 261 8184 7 24沙丁胺醇 24021480 2024022148 0 124 22(Salbutam01) 240 2222 3 10克仑特罗 276 7-2027 17276 7：2027 154 25(Clenbuter01) 276 72588 11班布特罗 3679=2939 17367 9293 9 169 25(Bambuter01) 36792717 30莱克多巴胺一D5(
11、Ractopamine D5)3069166 8 306 92166 8 133 27 17沙丁胺醇一D3(Salbutamol_D3) 242 91508 24291508 125 23 20克仑特罗D9 28582039 285 82039 155 25 15(Clenbuterol D9)8 3定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合对照品工作液中对应的保留时间偏差在25之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的对照品工作液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对
12、应的待测物。3农业部1063号公告一32008表2定性确证时相对离子丰度的最大允许误差()相对离子丰度 50 2050 lO20 10允许的最大偏差 20 士25 士30 土5084定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合对照品工作液进样，以标准溶液中被测组分峰与内标物面积的比值为纵坐标，对照品工作液中被测组分浓度为横坐标绘制工作曲线，用工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。克仑特罗、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗用克仑特罗D9内标定量，莱克多巴胺、氯丙那林用莱克多巴胺D5内标定量，沙丁胺醇、齐帕特罗、特布他林用沙丁胺醇D3内标定量。上述色谱
13、和质谱条件下，克仑特罗等11种8受体激动剂对照品的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A。8 5平行试验按上述步骤，对同一样品进行平行试验测定。8 6回收率试验本标准线性工作范围为：02 ngmL50 ngmL。阴性样品中添加对照品工作液，按样品制备步骤操作，测定后计算样品添加的回收率。在02 ngmL10 ngmL浓度范围内的添加回收率为50100。9计算试样中每种B一受体激动剂的含量以质量分数x计，数值以纳克每毫升(ngmL)表示，按式(1)计算：Xml”(1) m式中：m试样的色谱峰对应的某一种口一受体激动剂的质量，单位为纳克(ng)；”试样的稀释倍数；m试样的体积，单位为毫升(mL)。1
14、0重复性在同一实验室由同一操作人员完成的两个平行测定的相对偏差不大于20。农业部1 063号公告一32008附录A(资料性附录)克仑特罗等1 1种B一受体激动剂和内标对照品的液相色谱一串联质谱图(MRM图118：MRM 0f1 Chinel ES+1 “( 366 7292 7I 1 3 04“1 。1 I84 LT，T，rTrrH，Trr1r-1，。r0 50 l 00 l 50 2 00 2 50 300too 1i91，：mmC姗han，n，e：l蛆ES+，2 。t 609e4n J11，1，11，111111，P-_P_r_FP_PPj；P_PPPP，P，_P_-，_-r，一0 50
15、1 00 l 50 2 00 2 50 3 001003 享0 。、74 14：凇1唑嗽0 50 l 00 l 50 2 00 2 50 3 00l 78 8：MRM ofl Channel ES+10、。0j n ”“842238698 eg誉 叱埘”0 50 1 00 l 50 200 2 50 3 00100 1*6 13：姗M0C2h33“8ne115E9S； l4 g 5 44“1lo。蕊iF气丽蜀r丽矿100 1i5”“扪C2h7“6 7ne2l 02ES； l5 8h01 094 八 248胡1200 50 l_00 1_50 200 2 50 3 00100 j 11n5411
16、：M81 C2h85an8ne1203ES；l6 掌 842e4 13n j，J，S，0 50 l 00 1 50 2 00 2 50 3 001 58 9：MRM ofl Channel ES+7 1粤j 213 961删538141一j 八 “0焉矗1面墨j五了一n“ 0 50 l 00 1 50 2 00 2 50 3 001溴布特罗2班布特罗3西马特罗4西布特罗5克仑特罗6克仑特罗一D97氯丙那林图A 1007 1*4 6RM甜“h2a4n02neiE14S+8婶| 4 97“ni，r，P，P，1，fZl3H+r1，+r，+r，r，_，1，10 50 1 00 1 50 2 00 2
17、50 3 0011， 5：MRM ofl Channel ES+00 。 301 9163 8一j 2 72e4。、j 、n二LrrffTf，11rftllllllr十，1r，11rrrrT，、，Prrtt，111，PrrTTlll110 50 100 1 50 2 00 2 50 3 001 33 4：MRM ofl Chinel ES+0式0j 306 9；麟：l，、，4、i-，、，。，”0 50 1 00 1 50 200 2 50 3 00l 25 3：MRM ofl Chinel ES+00j n 242 9150 8、。 Jl 8 45“。j 0 50 1 00 1 50 200 2 50 3 0000j 1。i4 2“扪C2h2“5 8n)e115E1S+8享 3 90e4nj，=；：，3，、，、一 0 50 1 00 1 50 2 00 2 50 3 0000 1n25 1：”RM引C2h6aln8ne118E4S；gj 010 172 238 7 21。300 50 1 00 1 50 2 00 2 50 3 00 nmo8马布特罗9沙丁胺醇10莱克多巴胺11莱克多巴胺一D512沙丁胺醇一13313特布他林14齐帕特罗(8受体激动剂的浓度为20 ngml，)克仑特罗等11种B一受体激动剂和内标对照品的MRM图
