1、ICS 67120B 45中华 人民共和 国国家标准农业部1163号公告一12009动物性食品中己烯雌酚残留检测酶联免疫吸附测定法Determination of diethylstflbestrol residue in animal derived foodEnzyme linked immunosorbent assay method2009-0206发布 2009-0301实施中华人民共和国农业部发布刖 蟊农业部1 163号公告一1-2009本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国农业大学动物医学院、山东省兽药监察所。本标准主要起草人：沈建忠、高迎春、陈玲、冯修光、
2、万宇平、张素霞、何方洋、魏秀丽、冯才伟。本标准系首次发布的国家标准。农业部1 163号公告一12009动物性食品中己烯雌酚残留检测酶联免疫吸附测定法1范围本标准规定了动物性食品中己烯雌酚残留量的制样和快速检测一酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于猪肉、猪肝、虾样本中己烯雌酚残留量的快速筛选检测。可疑样品应用仪器方法进行确认。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT
3、 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样31样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。32样品的保存-20以下冰箱中贮存备用。4测定方法4 1方法提要和原理采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上包被偶联抗原，试样中残留的己烯雌酚与酶标板上的偶联抗原竞争己烯雌酚抗体，加入酶标记的羊抗鼠抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度，吸光度值与己烯雌酚残留量成负相关，与标准曲线比较即可得出已烯雌酚残留含量。42试剂和材料以下所有试剂，均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的二级水。42 1乙腈。42 2丙酮。42 3 j氯甲烷。
4、424氢氧化钠。42 5磷酸(85)。42 6己烯雌酚检测试剂盒：28保存。4 2 6 1 96孔板(12条8孔)：包被有己烯雌酚偶联抗原。4 26 2己烯雌酚系列标准溶液：0 pgLo1 pgLo3 pgLo9 pgI27 pgL81肛gL。4 2 6 3己烯雌酚抗体工作液。42 6 4酶标记物T作液。1农业部1 163号公告一120094 2 6 5 2倍浓缩缓冲液。4 2 6 6 20倍浓缩洗涤液。4267底物液A液。4 2 6 8底物液B液。4 2 6 9终止液。4 2 7乙腈丙酮溶液(84+16，vv)：取乙腈84mL和丙酮16mL，混匀。428 2molL氢氧化钠溶液：称取809氢
5、氧化钠，用100mI，水溶解，冷却至室温。429 6toolI磷酸溶液：100mL磷酸加去离子水150mL，混合均匀。4 210缓冲液工作液：用水将2倍浓缩缓冲液按1：1体积比进行稀释(1份2倍浓缩缓冲液+1份水)用于溶解干燥的残留物。28保存，有效期1个月。42 11洗涤液工作液：用水将20倍浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)用于酶标板的洗涤。28保存，有效期1个月。43仪器与设备431酶标仪：配备450 nm滤光片。4 3 2匀浆器。433涡旋振荡器。4 3 4离心机。435微量移液器：单道20弘L，50肛I。，100 pI，1 000 pL；多道250
6、btL。436天平：感量001 g。43 7分析天平：感量0000 01 g。438氮气吹干装置。44试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料；取制备后的空白样品，作为空白试料；取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 5测定4 5 1提取称取(2士o02)g匀浆后的试料，加乙腈丙酮(84+16，vv)6 mI。，振摇10 min，15(2，3 000 rmin离心10 min；取上清液30 mL，60。C水浴下氮气吹干；力氯仿05 mL，涡动20 S，加2 molL氢氧化钠溶液20mL，涡动30 s，3 000 rmin离心5mini取上清液10mL，
7、加6molI。磷酸溶液200肛L，涡动5 s，加乙腈30 mL萃取，振荡10 rain，3 000 rmin离心10 min；取上层有机相10 mL，60C水浴下氮气吹干；用缓冲工作液10mL溶解残留物，取50“L作为试样液分析。本方法的稀释倍数为6倍。4 5 2试样测定4521将试剂盒在室温(1925C)下放置1 h2 h。4522按每个标准溶液和试样溶液做2个或2个以上的平行实验，计算所需酶标板条的数量，插入板架。45 2 3加系列标准液或试样液50止到对应的微孔中，随BPJJtI己烯雌酚抗体工作液50 pL孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37 0C避光反应30 min。4524倒出孔中
8、液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体，加洗涤液工作液，农业部1 163号公告一12009250tL孔，5 s再倒掉孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。重复操作2遍以上(或用洗板机洗涤)。4525加酶标记物工作液100“L孔，用盖板膜盖板后置37C反应30 mln。4526取出酶标板，重复4524洗板步骤。4527依次加底物液A液和B渡各so弘乙7L，轻轻振荡混匀，379C下避光显色15 rain。4 5 28加终止液50“L7L，轻轻振荡混匀，设定酶标仪在450 nm波长处测量吸光度值。46结果判定和表述用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算，见式(1)：D相对吸光度值()一芋100“(1)I)“式中：B为标准(试样)溶液的吸光度值；Br一空白(浓度为0标准溶液)的吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应己烯雌酚标准品浓度(pgL)的自然对数作半对数图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，乘以其对应的稀释倍数即为样本中己烯雌酚的实际浓度。方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法进行验证。5检测方法灵敏度、准确度、精密度51灵敏度本方法在猪肉、猪肝、虾样品中己烯雌酚的检测限均为2“g蜒。5 2准确度本方法在3Lgkg12肛gkg添加浓度水平上的回收率均为60110。5 3精密度本方法的批内变异系数20，批间变异系数30。3
