1、ICS 65020B 04中华 人民共和 国国家标准农业部953号公告一62007转基因植物及其产品成分检测抗虫转研基因水稻定性PCR方法Detection of genetically modified plants and their derived productsQualitative PCR methods for pest-resistant rice transgenic for Bt gene20071218发布 2008-0301实施中华人民共和国农业部发布刖 置本标准附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委
2、员会归El。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院生物技术研究所、上海交通大学、中国农业科学院植物保护研究所、中国农业大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：金芜军、刘信、杨立桃、张永军、黄昆仑、宋贵文、李宁、沈平、彭于发、黄文胜、宛煜嵩。农业部953号公告62007转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bf基因水稻定性PCR方法1范围本标准规定了转胁基因抗虫水稻的定性PCR检测方法。本标准适用于转基因水稻及其产品中的CaMV35S启动子、NOS终止子、基因的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本规范的条款。凡是注明日期的引用文件。其随后所有的修
3、改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化sNT 1193 2003基因检验实验室技术要求SNT 1194-2003植物及其产品中转基因成分检测抽样和制样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1SPS基因SPS gene蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase)基因，在本标准中用作水稻内标准基因。3
4、2o基因GOS gene一个根部表达的水稻基因，在本标准中用作水稻内标准基因。3 3CaMV35S启动子CaMV35s promoter花椰菜花叶病毒(Caul班Dwr mosaic virus)35S的启动子。34NOS终止子NOS terminator根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒胭脂碱合酶(nopaline synthase)基因的终止子。3 5CrylAc基因CrylAc gene编码苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)CrylAc杀虫晶体蛋白的基因。36CrylAb基因CrylAb gene编码苏云金芽胞杆菌(Baci
5、llus thuringiensis)CrylAb杀虫晶体蛋白的基因。1农业部953号公告6200737CrylAVcr，lAc融合基因CrylAbCrylAc fusion geneCrylAb基因与CrylAc基因经人工拼接形成的基因。38转肌基因抗虫水稻transgenie insect-resistant rice with Bt(Bacillus thuringiensis)gene通过基因工程技术将外源CrflAc基因或CrylAb基因或DyfA6cry聃c融合基因导入水稻而培育出的抗虫水稻。3 9Ct值cycle threshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循
6、环数。4原理根据转Bf基因抗虫水稻中My35S启动子、NOS终止子、CrylAc基因或CrylAb基因或CrylAbCrylAc融合基因，以及水稻的内标准基因SPS基因、COS基因，设计特异性引物探针进行PCR扩增检测，以确定水稻及其产品中是否含有转基因抗虫水稻成分。5试剂除非另有说明，本方法试剂均为分析纯试剂和重蒸馏水。5 1琼脂糖。5 2溴化乙锭(EB)溶液：10mgmL。注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5 3 10 molL氢氧化钠(NaOH)溶液：在160 mL水中加入80 g NaOH，溶解后加水定容至200 mL，塑料瓶中保存。54 500 mmo
7、lL EDTA溶液(pH 80)：称取二水乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA2H20)186 g，加入70mLTk中，加入少量10toolLNaOH溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用10molLNa0H溶液调pH至80，加水定容至100 rrLL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 rain。5 5 1moiI。Tris-Hcl溶液(pH 8o)：称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至80，加水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 min。56 TE缓冲液(pH 8o)：分别加入1 molL Tris-HCl(
8、pH 8o)10 mL和500 mmolL EDTA(pH80)溶液2 mL，加水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 min。57 50TAE缓冲液：称取2422 gTris，用500mL水加热搅拌溶解，加入500mmolLEDTA溶液(pH 8o)i00mL，用冰乙酸调pH至80，然后加水定容至1 000mL。使用时用水稀释成1TAE。58加样缓冲液：称取溴酚蓝025 g，加入10mL水，在室温下过夜溶解；再称取二甲基苯腈蓝025 g，用10mL水溶解；称取蔗糖50 g，用30 mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100 mL，在4C下保存备用。59 1 mo
9、lLTris HC|(pH 75)：称取1211 g Tris溶解于800 mL水中，用浓盐酸调pH至75，用水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 rain。5 10苯酚：氯仿：异戊醇溶液：将苯酚、氯仿和异戊醇按照25：24：1的体积比混合。511氯仿：异戊醇溶液；将氯仿和异戊醇按照24：1的体积比混合。5 12 10ragmLRNaseA：将胰RNA酶(RNaseA)溶于10mmolLTris-HCI(pH 75)、15retoolLNaCl中，配成10ragmL的浓度，于100x2Jl热15rain，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于一20。2农业部953号公
10、告620075 13异丙醇。5 14 3 n o：L乙酸钠(rH 56)：称取4083 g三水乙酸钠溶解于800 rnL水中，用冰乙酸调pH至56，用水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 min。515 70乙醇(VV)。5 16抽提液(1 000mL)：在600mL水中加人693 g葡萄糖、20 g聚乙烯吡咯烷酮(K 30)(PVP)、1 gDIECA(diethyldithiocarbamic acid)，充分溶解。然后加入1 m01L Tris-HCl(pH 75)100 mL、05mdLEDTA(pH 8o)10mL，加水定容至1 000 rrL，4保存
11、，使用时加入02(vV)的p一巯基乙醇。5 17裂解液(1 000mL)：在600mL水中加入817 g氯化钠、20 g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、20 g聚乙烯吡咯烷酮(K 30)(PVP)、1 gDIECA(diethyldhhiocarbamic acid)，充分溶解，然后加入1 m。lI，Tds-HCl(pH 75)100mL、05molLETA(pH 80)4mL，加水定容至1 000mL，室温保存，使用时加入02(vV)的0巯基乙醇。518 DNA分子量标准。5 19 dNTPs：浓度为10 muoL的dATP、dlvrP、fGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸的等体积混合溶液
12、。5 20适用于普通FCR反应TaqDNA聚合酶(5UpL)及其反应缓冲液。5 21适用于实时荧光PCR反应Thq DNA聚合酶(5U”L)及其反应缓冲液。522植物DNA提取试剂盒。5 23石蜡油。5 24 PCR产物回收试剂盒。6仪器6 1通常分子生物学实验室仪器设备。62 PCR扩增仪。6 3实时荧光PCR扩增仪。64电泳槽、电泳仪等电泳装置。6 5紫外透射仪。66凝胶成像系统或照相系统。7抽样与制样按NYT 673或SNT 1194执行。8操作步骤8 1 DSA提取和纯化81 1试样预处理按NYT 674执行。812 DNA模板制备采用NYT 674所描述的方法，或经认证适用于水稻及其
13、产品DNA提取的试剂盒方法，或按下述方法执行。DNA模板制备时设置不加任何试样的空白对照。称取200mg经预处理的试样，在液氮中充分研磨后装入液氮预冷的15mL或2 rrL离心管中(不需研磨的试样直接加入)。加人1 rrL预冷至4的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5 min，4条3农业部953号公告62007件下10 0009离心15rain，弃上清液。加人600“L预热到65。C的裂解液，充分重悬沉淀，在65。C恒温保持40 rnin，期间颠倒混匀5次。窒温条件下，10 000 g离心10 rain，取上清液转至另一新离心管中。加入5”L RNase A，37恒温保持30 mln。分别用等
14、体积苯酚：氯仿：异戊醇溶液和氯仿：异戊醇溶液各抽提一次。室温条件下，10 0009离心10 rnin，取上清渡转至另一新离心管中。加入23体积异丙醇，1lo体积3moiL乙酸钠溶液(pH 56)，一209C放置2 h3 h。在4。C条件下，10 000 g离心15min，弃上清液，用70乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀。加人50LTE(pH 8o)溶解沉淀，所得溶液即为样品DNA溶液。8 1 3 DNA溶液纯度测定和保存将DNA溶液适当稀释，测定并记录其在260 DAn和280 nrn的紫外光吸收率，OI)2。值应该在0051的区间内，0D2。OD2。比值应介于1420之间，根据0132。
15、值计算DNA浓度。依据测得的浓度将DNA溶液稀释到25 ng”L，一20保存备用。8 2 PCR反应(8 2 1和8 2 2选一)8 2 1方法一见附录A。822方法二见附录B。9结果表述9 1在试样的PCR反应中，未检出SPS基因和或COS基因，结果表述为“样品中未检出水稻成分”。9 2在试样PCR反应中，检出基因，对于水稻及以水稻为唯一原料的产品，结果表述为“样品中检出转基因水稻成分”；对于混合原料产品，结果表述为“样品中检出鼠基因”，需要进一步对加工原料进行检测确认。9 3在试样PCR反应中，未检出B基因，但检出CaMV35S启动子和或Nos终止子，表明该样品含有转基因成分，结果表述为“
16、样品中检出CaMV35S启动子和或Nos终止子，未检出转基因水稻成分”。94在试样的PCR反应中，检出水稻内标准基因，但未检出基因、CaMV35S启动子和NOS终止子，结果表述为“样品中未检出转基因水稻成分”。10防污染措施防污染措施应符合SNT 1193或NYT 672的规定。4A 1引物附录A(规范性附录】普通PCR方法农业部953号公告62007引物序列见表A1，用TE缓冲液(pH 80)或双蒸水分别将表A1引物稀释到10 pmolL。表A 1 PCR引物序列检测基因 引物 引物序列(5一3) PCR产物大小(bp)Primerl SPSF1：TFGcGCcTGAACGGATATSPS
17、277Primer2 SPSR1：GGAGAAGCACTC沾ACGAGGPrimerl 35SF1：GCTCCTACAAATG(：CATcATTGCCd彳V35S195Primer2 35S RI：GATAGTGGGATTGTGcGTCATCCCPrimer NOSF1：GAATC(聃TrX粥TC兀-G0S 180Primer2 NOSR1 1TTATCCTAGTTT删APrknerl BtF1：GAAGGTITGAGCAATCTCTACBt 301Primer2 BtR1：CGATCAGCA二TAGTAAGGTCGTA 2 PCR检测A21 PCR反应A 2 1 1试样PCR反应在PCR反应
18、管中按表A2依次加入反应试剂，轻轻混匀，再加约50“L石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)。每个试样3次重复。离心10 s后，将PCR管插入PCR仪中。反应程序为：95变性5rain；进行35次循环扩增反应(94。C变性1rain，56退火30 s，72延伸30 s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长)：72延伸7 min。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测或在4下保存待用。表A 2 PCR反应体系试 剂 终浓度 单样品体积ddH20 2875L10P(1R缓冲液 1 5 uL25 retoolL MgCl2 25mmolL 5 uLdNTPs
19、 02mmolL 4 uL10 umolLPtimerl 05 umolL 25止10 pmolL Primer2 05imolL 25“L5U“LTaq酶 0025U“L 025“L25 ng*L DNA模板 I ngL 20“L总体积 50 uL注：PCR缓冲液中有Mg+的，不应再加MgCIz。A 2 1 2对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。农业部953号公告62007阴性对照是指用非转基因水稻材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；设置两个阳性对照，分别用转基因抗虫水稻材料中提取的DNA、以及转基因水稻含量为o1的永稻DNA作为PCR反应体系的
20、模板；设置两个空白对照，分别用无菌重蒸水和DNA制备空白对照作为PCR反应体系的模板。上述各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与A211相同。A2 2 PCR产物电泳检测将适量的琼脂糖加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成浓度为2o(wV)的琼脂糖溶液，然后按每lOO mL琼脂糖溶液中加入5 tLL EB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放人1TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。吸取7“L的PcR产物与适量的加样缓冲液混合后加入点样孔中，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2 Vcm条件下电泳。A 23
21、凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照A3的规定对PCR扩增结果进行分析。如需进一步确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，需对PCR扩增的DNA片段参照A24和A25的规定执行。A 24 PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。A25 PCR产物测序验证回收的PCR产物进行序列测定，并对测序结果进行比对和分析，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。A3结果分析如果阳性对照的PCR反应中，水稻内标准S
22、PS基因、CaMV35S启动子和或N0s终止子和基因得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出SPS基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。在PCR反应体系正常工作的前提下，检测结果通常有以下几种情况：a)在试样的PCR反应中，内标准SPS基因片段没有得到扩增，或扩增出的DNA片段与预期大小不一致，表明样品未检出SPS基因。b)在试样PCR反应中，内标准SPS基因和B基因均得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，无论CaMV35S启动子和或NOS终止子是否得到扩增，表明样品
23、检出基因。c)在试样PCR反应中，内标准sPS基因、CaMV35S启动子和或NOs终止子得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，但基因没有得到扩增，或扩增出的DNA片段与预期大小不一致，表明样品检出CaMV35S启动子和或N06终止子，未检出Bf基因。d)在试样的PCR反应中，内标准SPS基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，基因、CaMV35S启动子和NOS终止子没有得到扩增，表明样品未检出基因。附录B(规范性附录)实时荧光P(m方法农业部953号公告62007B 1引物探针引物探针序列见表131，用TE缓冲液(pH 8o)或双蒸水分别将表B1引物探针稀释到101molL
24、。表B1荧光阿t引物探针序列检测基因 引物探针 引物探针序列(5一3) PCR产物大小(bp)Primerl SPS F2：TT删GAACGGATATSPS Primer2 SPSR2CGGTTGATCTmCGGGATG 81Probe SPSP：FAMTCCGAGCCGTCCGTGCGTCTAMRAPrimerI GOS F：TTAGCCTCCCGCTGCAGAGOs Primer2 GOSR：AGAGTCCACAAGTGCTCCCG 68Probe COS P：FAM一0岔剃G丁G丁GGr丁i，Gr册rn瑚一TAMRAPrimerl 35S F：COACAG3YjGTCCCAAAGA一Cd
25、35S Primer2 35SR：AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC一 74Probe 35S P：FAMTGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCTAMRAPrimerl NOSF2：ATCGTTCAAACATTTGGCANos Primer2 NOSR2：ATIGcGGGACTCTAATCATA 165Probe NOSP：FAMCATCC,CAAGACOGzCK2AACAGGTAMRAPrimerl BtF2：GGGAAATGCGTATTCAATTCAACPrimer2 Btft2TTCTGGA删AACAATGG 73Probe Bt P2：FAMACATGAACAGC
26、GCA2TTGACCACAGCTAMRABt BtF3：GACCCTCACAGIWTTGGACATTGPrimerlPrimer2Bt R3：ATTTCTCTGGTAAG懈ACACT93BtP3：FAM一rcOCGAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATProbeCC一朋繇纠注：SPS基因和COS基因任选其一；2组B基因扩增检测的引物探针任选其一。B，2 PCR检测B21对照设置阴性对照以非转基因水稻DNA为模板；设置两个阳性对照，分别用转基因抗虫水稻材料中提取的DNA，以及转基因水稻含量为01的水稻DNA作为PCR反应体系的模板；空白对照以重蒸馏水代替DNA模板。R 22 PCR
27、反应体系按表B 2配制PCR扩增反应体系，也可采用等效的实时荧光PCR反应试剂盒配制反应体系，每个试样和对照设3次重复。7农业部953号公告62007表B 2实时荧光PCR反应体系试剂 终浓度 单样品体积ddH20 266 uL10PcR缓冲液 1 5 uL25 ramoIL MgCiz 25 rcmloiL 5“LdNTPs 02 retoolL 4“L10 pmolL Probe 02皿molL 1“L10 ranolL Primerl 04”molL 20 uL10脚-aolL Primer2 04“molL 2O uL5U“LTaq酶 004UuL O4 uL25 ng止DNA模板 2
28、 nguL 40uL总体积 50止注：PCR缓冲液中有Md+的，不应再加MgClz。23 PCR反应PCR反应按以下程序运行。第一阶段95。C10 rain第二阶段9515 s、6060 s，循环数40；在第二阶段的退火延伸时段收集荧光值，PCR反应结束后，根据收集的荧光曲线和ct值判定结果。B3结果分析B31阈值设定实时荧光PCR反应结束后，设置荧光信号阈值，阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。B32质量控制在内源参照基因SPS和GOS基因扩增时，空白荧光曲线平直，阴性对照和阳性对照出现典型的扩增曲线，或空白对照荧光值低于阴性对照和阳性对照
29、荧光值的15；在外源基因(序列)CaMV35S、NOS和扩增时，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直，阳性对照出现典型的扩增曲线，或空白对照和阴性对照的荧光值低于阳性对照荧光值的15，表明反应体系工作正常。否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。B 33结果判定在PCR反应体系正常工作的前提下：待测样品基因(序列)检测ct值大于或等于40，则判定样品未检出该基因(序列)；待测样品基因(序列)出现典型的扩增曲线，且检测ct值小于或等于阳性对照的Ct值，则判定样品检出该基因(序列)；待测样品基因(序列)出现典型的扩增曲线，检测ct值大于阳性对照的Ct值但小于40，应进行重复实验，如重复实验的外源基因(序列)出现典型的扩增曲线，且检测Ct值小于40，则判定样品检出该基因(序列)。8
