农业部953号公告-2-2007 转基因植物及其产品成分检测 抗虫玉米CBH351及其衍生品种定性PCR方法.pdf
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1、ICS 65020B 04中华人民共和国国家标准农业部953号公告一22007转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米CBH351及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived productsQualitative PCR method for insect-resistant maize CBH351 and its derivates20071218发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 声本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位:农
2、业部科技发展中心、上海交通大学。本标准主要起草人:张大兵、刘信、杨立桃、宋贵文。农业部953号公告22007I农业部953号公告一22007转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米CBH351及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了转基因抗虫玉米CBH351转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因抗虫玉米CBH351及其衍生品种,以及制品中CBH351的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本
3、。凡是不注明日期的引用文件,其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1zSSlb基因zSSEb gene编码玉米淀粉合酶异构体zSTS一2的基因。3 2CBH351转化体待异性序列event-specific sequence of CBH351外源插人片段3 7端与玉米基因组的连接区序列,包括NOS终止子3 7端部分序列和玉米基因组的部分序列。4原理根据转基因抗虫玉米CBH351转化体特异性序列设计特异性引物,对试样进行PCR扩增
4、。依据是否扩增获得预期225 bp的特异性DNA片段,判断试样中是否含有转基因抗虫玉米CBH351。5试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。51琼脂糖5 2 10 gL溴化乙锭溶液称取10 g溴化乙锭(EB),溶于100mL水中。注:溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5 3 10toolL氢氧化钠溶液称取氢氧化钠(NaOH)800 g,先用160 mL水溶解后,再加水定容到200mI,。5 4 500 mmolL乙二铵四乙酸-ifl溶液(pH 8 0)称取186 g乙二铵四乙酸二钠(EDTANa。),加入70mL水中,再加入适量氢氧化钠溶液(53)
5、,加农业部953号公告22007热至完全溶解后,冷却至室温,用氢氧化钠溶液(53)调pH至80,加水定容至i00 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 min。55 1 mm,iL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pn 8 0)称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800 mL水中,用盐酸调pH至80,加水定容至1 000mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 rain。56 TE缓冲液(pn 8、01分别量取10 mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(55)和2 mI乙二铵四乙酸二钠溶液(54),加水定容至1 000 mL。在1034 kPa(1210c)条件下灭菌20
6、 rain。5 7 50XTAE缓冲液称取2422 g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用300mL水加热搅拌溶解后,加100mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54),用冰乙酸调pH至80,然后加水定容到1 000mL。使用时用水稀释成1TAE缓冲液。58加样缓冲液称取2500mg溴酚蓝,加10mI,水,在室温下溶解12h;称取2500mg二甲基苯腈蓝,用10mL水溶解;称取500 g蔗糖,用30 rrlL水溶解,混合三种溶液,加水定容至100mL,在4下保存。59 DNA分子标准可以清楚地区分50 bp1 000 bp的DNA片段。510 dNrPs混合溶液将浓度为10 retoolL的dATP、dT
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