1、ICS 67120B 45中华人民共和国国家标准农业部958号公告一22007猪鸡可食性组织中四环素类残留检测方法高效液相色谱法mgh performance liquid chromatographic method for thedetermination of tetracyclines residues in pig and chickenedible tissues20071229发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 昌农业部958号公告一22007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草人：袁宗
2、辉、余欢、陶燕飞、陈冬梅、王玉莲、黄玲利、肖爱国、彭大鹏、刘振利、戴梦红。本标准系首次发布的行业标准。1范围农业部958号公告-2-2007猪鸡可食性组织中四环素类残留检测方法高效液相色谱法本标准规定了猪鸡可食性组织中四环素类残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于猪的肌肉、肝脏、肾脏、鸡的肌肉、肝脏组织中四环素、土霉素、金霉素、多西环素的残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期
3、的引用文件，其最新版本适用于本标准。6BT 112000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则(ISOIEC Directives，Part 3，1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ)GBT 6682-1992分析实验室用水规则和试验方法农业部农牧发200311号兽药残留试验技术规范(试行)3制样31样品的制备取新鲜或冷冻空白、供试组织，绞碎使均匀。32样品的保存-20以下贮存。4测定方法4 1方法提要或原理试料中残留的4种四环素类药物用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提
4、取，固相萃取柱净化，用高效液相色谱一紫外检测器法测定，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1盐酸四环索：含量不少于95。4 2 2盐酸金霉素：含量不少于95。423盐酸土霉素：含量不少于95。424盐酸多西环索：含量不少于95。4 2 5甲醇：色谱纯。4 2 6乙腈：色谱纯。4 2 7无水磷酸氢二钠。42 8柠檬酸。4 29草酸。l农业部958号公告一2200742 10乙二胺四乙酸二钠。42 11 001 moI，L草酸水溶液的配制称取草酸126 g，加水溶解，稀释到1 000 mL。42 12 5三氯乙酸溶液
5、的配制称取三氯乙酸50 g，加水溶解，稀释到1 000 mL。42 13 Mcl!vaine-NazEDTA缓冲液称取无水磷酸氢二钠284 g，加水溶解，稀释到1 000 mL。称取柠檬酸单水合物210，加水溶解，稀释到1 000 mL。将上述柠檬酸溶液1 L与无水磷酸氢二钠溶液625 mI，混合，加入乙二胺四乙酸(EDTA)二钠盐605 g，溶解，混匀。用01 tooLL HCl或01 moLL NaOH调节pH至401005，4保存。4 214冼脱液的配制称取草酸126 g，加甲醇溶解，稀释到1 000 mI。4215标准贮备液的配制分别取盐酸四环素、盐酸土霉素、盐酸金霉素、多西环素的标准
6、品约100 mg，精密称定，用适量流动相A+乙腈(1：1)溶解，定容至10 mL，得到按四环素、土霉素、金霉素和多西环素计为i ragmL的标准贮备液，ooC避光保存，有效期为2个月。43仪器和设备4 31高效液相色谱仪(配紫外检测器)。4 32天平：感量001 g。43 3分析天平：感量0000 01 g。434离心机。43 5电热恒温水浴锅。43 6旋涡混合器。43 7超声波清洗机。43 8离心管。439氮吹仪。4310组织匀浆机。4 3 11固相萃取柱HLB，60 rag3 mL。4 4测定步骤44 1试料的制备试料的制备包括：一取绞碎并均匀的供试样品，作为供试试料。一取绞碎并均匀的空白
7、样品，作为空白试料。取绞碎并均匀的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。44 2提取称取5 g+005 g试料，置于25 mL离心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液10 mL，漩涡混匀，155 000 rrain离心15 rain，上清液转移到另一洁净的50 mI。离心管中，残渣再用Mcllvainc-Na：EDTA缓冲液10mL重复提取，合并两次提取液，加入5三氯乙酸溶液2ml。，漩涡混匀，10 000 rrain离心10 rain，上清液转移至另一洁净的50 mI。玻璃离心管中，待净化。44 3净化HLB柱依次用甲醇、水3 mI。活化。取提取液上柱，待液体全部流
8、出后用水5 mL淋洗，洗脱液2农业部958号公告220073mI就脱，45。C50。C水浴下氮气吹干洗脱液，用草酸溶液1omL溶解残余物，15|。C 4000 rmin离心5 min，取上清液供高效液相色谱检测。4 4 4标准曲线的绘制准确量取标准贮备液适量，用甲醇稀释成浓度为50 pg1。、100 pgL、250 pgI，、500 pgL、1 000 HgI、l 500 t,gL的混合标准溶液，供高效液相色谱分析，每个浓度进样3针，用平均峰面积与相应的标准溶液浓度作标准曲线，并计算回归方程及相关系数。4 4 5测定4 4 51液相色谱条件色谱柱：C18柱，250 mmX46 mm(id)，粒
9、径5 Mm。流动相：A相：001 moI。I。的草酸水溶液，B相：乙腈，C相：甲醇。表1梯度洗脱程序ff：jrN(min) A相B相C相(VVv) 流速(mI。min)olo 83116 1lO25 603010 1检测波长：355 rim。进样量：100“L。柱温：35。4 4 5 2测定法取试样溶液和相应的标准溶液作单点或多点校准，按外标法，以峰面积定量，即得。45空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4 6结果计算和表述按式(1)计算试料中四环素类药物的残留量(tLgkg)： x一糌(1)式中：x一 试料中四环素类残留量，ngkg；A 试样溶液中四环素类药物的峰面积；
10、Ar 标准工作液中四环素类药物峰面积；D一 标准工作液中四环素类药物的浓度，“gL；v 溶解残余物所得试样溶液体积，mL；w r一一组织样品质量，g。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度本方法在猪鸡肌肉组织中的检测限均为10 pgkg，定量限均为20 pgkg，在猪鸡肝脏组织中检测限均为25 pgkg，定量限均为50 pgkg，在猪肾脏组织中检测限均为30 pgkg，定量限均为50 pgkg。52准确度本方法在20 p-gkg1 200“gkg添加浓度的回收率为70110。53精密度本方法的批内、批间变异系数cV20。农业部958号公告220074附录A(资料性附录)高效液相色谱图图A 1 四环素类药物(土霉素、四环素、金霉素、多西环素)标准溶液浓度为100gL色谱图图A 2猪肌肉添加四环素类药物(20 l喀,kg)色谱图“：。o叫舢”：”，o帖q农业部958号公告22007b gfl E l iI LL“ I|_、 J L图A 3猪肝脏添加四环素类药物(50斗gkg)色谱图删，：3：。啪_
