1、ICS 67120B 45中华人民共和国国家标准农业部958号公告一32007动物源食品中莱克多巴胺残留量的测定高效液相色谱法一质谱法The determination of ractopamine in edible animal tissuesby HPLC-MS method20071229发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部958号公告一32007本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位：农业部畜禽产品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：单吉浩、姜艳彬、蔡英华、王海、刘勇军、吴银良、刘兴国、李艳华。农业部958号公告一32
2、007动物源食品中莱克多巴胺残留量的测定高效液相色谱法一质谱法1范围本标准规定了用液相色谱一质谱法测定动物源食品中莱克多巴胺残留量的方法。本标准适用于猪肌肉、猪肝和猪肾中莱克多巴胺残留量的测定。本标准方法的线性范围为0005 mgLo5 mgL。本标准方法在猪肌肉、猪肝和猪肾中的检出限为0002 ragkg。2原理样品经过甲醇提取，用口一盐酸葡萄糖醛酸酶溶液消解，用乙酸乙酯再次提取后过酸性氧化铝小柱净化，用合适的溶剂选择洗脱后，供高效液相色谱定量(质谱检测器)测定。外标法定量。3试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。3 1莱克多巴胺，纯度98。32硼
3、酸钠。33氢氧化钠。3 4乙酸胺。35甲醇：色谱级。36乙腈。37乙酸乙酯。3 8 B一盐酸葡萄糖醛酸酶。3 9氢氧化钠溶液(50 tooLL)：取氢氧化钠饱和溶液14 mL，加水稀释至i00 mL。3 10乙酸胺溶液(o025 moLL，pH一50)：取乙酸胺02 g，加水使溶解并稀释约至90 mI，用50 tool。IJ氢氧化钠溶液调节pH至50后用水定容至100 mL。3 11硼酸钠溶液(o025moLL，pH一103)：取硼酸钠095 g，加水使溶解并稀释约至90mI。，用50tooLL氢氧化钠溶液调节pH至103后用水定容至100 mI，。3 12 02甲酸溶液：取i ml。甲酸溶解
4、水中并定容至500 ml，。3 13流动相：02甲酸一乙腈(84+16)，用前过滤膜。314莱克多巴胺标准储备液：准确称取莱克多巴胺标准品，加甲醇使溶解并稀释至浓度约为I0 ragml，的储备液，置2。C8水箱中保存，有效期3个月。315莱克多巴胺标准工作液：准确量取适量莱克多巴胺标准储备液，用流动相溶液稀释成适宜浓度的莱克多巴胺标准工作液。316酸性氧化铝固相萃取小柱(3 mL，500 mg)。317针筒式微孔过滤膜(o45m)。1农业部958号公告一320074仪器4 1液相色谱一质谱联用仪(I。CMS)。4 2分析天平：感量10000 l g。4 3天平：感量o01 g。4 4 50 m
5、L磨口玻璃离心管，具塞。4 5 5 mL磨口玻璃离心管，具塞。4 6超声波清洗器。4 7酸度计。4 8离心机。4 9振荡器。4 10旋转蒸发器。4 11涡旋式混合器。412恒温加热器。4 13 Nz一蒸发器。4 14组织匀浆机。5采样(取样)51试样的制备猪肝、猪肉和猪肾：取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使均匀。试样放人聚乙烯瓶中于16。C20条件下保存。5 2试料的制备取绞碎后的供试样品，作为供试材料。取绞碎后的空白样品，作为空白材料。取绞碎后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。6分析步骤61提取称取猪肌肉(或猪肝或猪肾)试样10 g(精确到001 g)，置30 mL
6、匀浆杯中，加20 mI。甲醇，10 000 rrain匀浆0，5 min，匀浆液转入50 mL离心管中，混合振荡5 rain，4 000 rmin离心10 min，上清液转入100mI。旋转蒸发瓶中。用20mI，甲醇洗匀浆机刀头及匀浆杯，转人50mI，离心管中洗残渣，混合振荡5min，4 000 rmin离心5nlin。上清液合并于100mL旋转蒸发瓶中，在40水浴中旋转真空蒸发至干，加2 m10025 moLI。乙酸胺(pH=5o)溶液和20肛I的p盐酸葡萄糖醛酸酶溶液，涡旋震荡20 s，放人65。C恒温箱中2 h。取出后加入4miX)025moLL硼酸钠溶液(pH=103)，涡旋震荡20
7、s，加入15 HlI，乙酸乙酯，混合振荡1 min，静止分层，取上层有机相。在下层水相中加入15 mI。乙酸乙酯，混合振荡1 win，静止分层，合并两次上层有机相。在40。C水浴中旋转真空蒸发至5 mL左右，作为备用液。6 2净化用5 mL乙酸乙酯润洗酸陛氧化铝固相萃取柱，将上述备用液过酸性氧化铝小柱，5 mI，乙酸乙酯淋洗，真空抽二F。用10 fnL甲醇洗脱，真空抽干，收集洗脱液，在40。C下氮气吹干，加入05 mL流动相溶液，涡旋震荡20 s，溶液用滤膜过滤(或高速离心后取上层清液)，作为试样溶液，用高效液相色谱一质谱(LC MS)N定。6 3标准曲线的制备2农业部958号公告一32007
8、准确量取适量莱克多巴胺标准工作液，用流动相溶液稀释成浓度分别为0005 mgI0 01 ragL、005 ragI0 10 mgI0 50 ragI。的莱克多巴胺标准溶液。供高效液相色谱一质谱分析。以莱克多巴胺浓度为横坐标，离子峰面积积分值为纵坐标，计算标准曲线或求线性回归方程。64仪器参考条件6 4 1色谱参考条件色谱柱：c1 8柱，150mmX 21(id)，粒径5 pm，或相当者。流动相：02甲酸+乙腈(84+16)。进样体积：21，。柱温：30。流速：02 ml，min。6 4 2质谱参考条件电离方式：电喷雾电离源(ESI+)。离子源温度：110。脱溶剂温度：220。毛细管电压：350
9、 kV。锥7L电压：25 V。气体流速：350 Lh。RF透镜电压：05V。萃取锥孔电压：5 V。离子能量：10V。选择离子检测(SIR)质荷比(MZ)：302、284、266、164。6 5测定取适量试样溶液和相应的标准工作溶液，作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中的莱克多巴胺响应值均应在仪器检测的线性范围之内。以试样峰与标准溶液峰相对保留时间定性。标准溶液和试样溶液的液相色谱图见附录A。6 6空白实验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。7结果计算试料中莱克多巴胺的残留量以质量分数w计，单位以微克每千克(tgkg)表示，按公式(1)计算： W一裂一百1
10、e=_(1)式中：A试样溶液中莱克多巴胺的峰面积；As一标准溶液中莱克多巴胺的峰面积；风 标准t作液中莱克多巴胺的质量浓度，pgL；V试样溶液定容体积，mI，；m 试料的量，g。计算结果表示到小数点后两位。8精密度在熏复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的20以大于这两个测定值的算术平均值的20的情况不超过5为前提。3农业部958号公告一32007附录A(资料性附录)2 00 4 00 600 8 00 1000图A 1莱克多巴胺标准溶液50 pL)的SIR色谱图10092 00 4()0 6 00 8 00 2 00 4130 6 00 800图A 2空白
11、猪肌肉和空白猪肌肉中添加莱克多巴胺标准溶液12斗gkg)后的SIR色谱图00100农业部958号公告一320072oo 4 oo 6 oo 800图A 3空白猪肝和空白猪肝中添加莱克多巴胺标准溶液后(2 t,gkg)的SIR色谱图100200 400 600 800ES+TIC 10030ES2 00 400 6 00 8 00ES+C30ES图A 4空白猪肾和空白猪肾中添加莱克多巴胺标准溶液后(2 Itgkg】的SIR色谱图农业部958号公告一3200760 80 l00120140160180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500图A5莱克多巴胺标准溶液50ngmL)后的全扫描液相色谱一质谱(LCMS)图
