1、ICS 65. 120 B 20 望中华人民共和国国家标准GB/T 20190-2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应CPCR)法Detection of bovine , sheep and goat-derived material in feeds- Qualitative polymerase chain reaction (PCR) method 2006-05-17发布2006-09帽01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员全061106000231 G/T 20190-2006 前言本标准的附录A为规范性附录。本标准由全国饲料工业标准
2、化技术委员会提出。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。本标准主要起草人:杨曙明、宋荣、程宪国、高生、赖卫华、王彤。I GB/T 20190-2006 51 含牛羊源性成分的动物源性饲料的使用，一直被认为是疯牛病传播的主要途径，禁止疫区含牛羊源性成分的动物掠性饲料的生产、流通和使用，成为预防疯牛病感染、流行的主要手段之一。1996年欧盟提出了动物源性饲料中牛羊掠性成分的检测方法CEUR18096EN) 0 2002年我国发布了中国出入境检验检疫行业标准SN/T1119-2002 进出口动物摞性饲料中牛羊掘性成分检测方法PCR法机用于检测动物源
3、性饲料。我国没有针对配合饲料和浓缩饲料等饲料产品中牛羊源性成分的检测标准，EUR18096EN和SN/T 1119一2002方法适用于动物源性饲料，在DNA提取上不适用于以植物为主要基质的配合饲料和浓缩饲料。本方法是在SN/T1119-2002、欧盟方法的基础上提出，在大量实验数据基础上建立起来的。E 1 范围饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应CPCR)法本标准规定了PCR方法对饲料中牛羊源性成分定性检测。GB/T 20190-2006 本标准适用于饲料中牛羊源性成分的定性检测，本方法的最低检出限为0.25%。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡
4、是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理根据牛羊遗传物质的特异性，通过检索基因库或专利库，选择牛羊特异性的DNA序列，该序列必须在同类动物(无论什么品种)中都具有高度保守性，而其他动物皆不含有。利用种属特异性的引物通过PCR扩增这一特定的DNA序列，通过电泳分离PCR产物，以标准长度的PCR产物作对照，检测PCR扩增出的这一特定的DNA片断，判断是否含有牛羊源性成分。此外，通过限制
5、性内切酶酶切反应，进一步判断结果。通过对PCR扩增的特定DNA片断进行测序，与标准序列进行比较，来确认检测结果。4 试荆与材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。4. 1 三程甲基氨基甲烧盐酸(Tris-HCl)溶液，1mol/L. pH值为8.0:在800mL去离子水中榕解12 1. 1 g三起甲基氨基甲皖(Tris)，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。4.2 三起甲基氨基甲皖盐酸(Tris-HCl)榕液，1mol/L , pH值为7.5:在80mL去离子水中榕解12.11 g Tris，冷却至室温后用浓盐酸
6、调节溶液的pH值至7.5，加水定容至100mL，分装后高压灭菌。4.3 氯化铀溶液，5mol/L:在80mL水中溶解29.22g氯化锅，加水定容至100mL。4.4 乙二胶四乙酸二铀盐(EDTA)溶液，500四mol/L:称取186.1 g二水乙二胶四乙酸二铀(EDTANaz 2HzO)，加入700mL 水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化铀溶液调pH值至8.0，用水定容到1L，分装后高压灭菌。4.5 澳代十六烧基三甲胶(CTAB)提取缓冲液1:在800mL去离子水中加入46.75 g氯化铀，摇动容器使溶质完全溶解，然后加入50mL Tris-HCl溶掖(4.1)和20mL E
7、DTA溶液(4.的，然后定容至1L , 分装后高压灭菌。4.6 澳代十六烧基三甲胶(CTAB)提取缓冲液II:在800mL去离子水中加入46.75 g氯化铀，20g澳代十六烧基三甲胶(CTAB)，摇动容器使溶质完全榕解，然后加入50mL Tris-HCl榕液(4.1)和20mL EDTA溶液(4.4)，用水定容至1L，分装后高压灭菌。4. 7 核糖核酸酶A(RNaseA)贮备液:将10mg RNase A溶解于987L水中，加入10LTris-HCl GB/T 20190-2006 溶液(4.2)，加入3L氯化铀溶液(4.3)，于1000C水浴中保温15min，冷却到室温后，分装成小份保存于一
8、200C。4.8 Tris饱和苯酣和三氯甲皖混合液，V(Tris饱和苯酣)+V(三氯甲烧)=1+1。4. 9 三氯甲烧和异戊醇混合液，V(三氯甲皖)+V(异戊醇)=24+1.4. 10 异丙醇。4. 11 乙酸锅溶液，3mol/L:在80mL水中，加入40.81 g三水合乙酸铀，溶解后用冰乙酸调节pH值到5.2，用水定容到100mL，分装后高压灭菌。4.12 体积分数为75%的乙醇。4.13 Tris-EDTA(TE)缓冲液，pH值为8.0:在800mL水中，依次加入10mL Tris-HCl溶液(4.1)和2 mL EDTA溶液(4.4)，用水定容副可7分装后高压74. 14 正己炕。4.1
9、5 Taq DNA聚合酶(54. 16 牛源性成分检测5-GTAGGCT 4. 17 羊源性成5-TATTA 5-CCCTG 4. 18 4. 24 琼脂糖。4.25 4.26 4.27 4.28 石蜡油。4.29 DNA 测序试剂。4.30 体积分数为95%的乙醇。4.31甲酷肢。5 仪器5. 1 实验室常用仪器设备。5.2 PCR扩增仪。5.3 电泳仪。5.4 凝胶成像仪或紫外透射仪。5.5 DNA序列分析仪。5.6 高压灭菌锅。2 甲睛蓝250mg，用L，在40C中保存。GB/T 20190-2006 6 操作步骤6. 1 试样的预处理50 g固体样品经粉碎，保持其颗粒大小在0.125m
10、m以下。6.2 模板DNA的提取和纯化6.2.1 CTAB法提取模板DNA称取100mg经预处理的试样，加300L冰上预冷的CTAB提取缓冲液lC4.5)。加入500L650C 预热的CTAB提取缓冲液II(4. 6) ，1昆匀，650C保温30min90 min，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷却12 000 r/min离心5心5min，弃上清液待测或于200C 分离，取水相，颠倒混匀，室、次加入800L12 000 r/min离I()中，待测或于20。6.2.3 模板DNA可用等效DNAt6.3 试样的PCR反应在200L或500L的脱氧核糖核酸(dATP，dCTP, d DNA(25 ng50
11、 ng) 10L、TaqDNA 50L石蜡油(有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油)。每个试样2次重复。in，使有机相和水相溶液(4.11)，轻缓200LTE缓冲心1Qfmin，弃上清液后，依乙回事(4.12)洗涤沉淀。以4000r/min离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。950C恒温1min3 min;进行30次扩增反应循环(950C恒温30s60 s、560C恒温30s60 s、720C恒温30s60 s);然后720C恒温5min，取出PCR反应管，对反应物进行电泳检测或在40C保存。在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。阴性对照是指不含牛或羊成分的饲料中提取的
12、DNA作为PCR反应体系的DNA模板;阳性对照是指含牛或羊成分的饲料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板;空白对照是指用无菌重蒸锢水或不含目的DNA的试剂作为PCR反应体系的DNA模板。上述对照PCR反应体系中，除模板外其余组3 G/T 20190一2006分相同。6.4 PCR产物的电泳检测将适量的琼脂糖加入电泳缓冲液中，加热将其溶解，配制成质量分数为1.5%的琼脂糖溶液，然后按每100mL琼脂糖榕液中加入5L澳化乙链榕液的比例，加入澳化乙键榕液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，室温下凝固成凝胶后，放入电泳缓冲液中。在每个泳道中加入5L8L的PCR产物(需和上样缓冲液混合)，其中一个泳
13、道中加入DNA分子量标记，接通电源，9V/cm电压，电泳20 min30 min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝肢成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。6.5 PCR产物的酶切检测PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。将30LPCR反应液按PCR产物回收纯化试剂盒说明进行。牛、绵羊、山羊PCR产物均用Sau3AI进行酶切。具体操作为:将回收纯化的PCR产物放入酶切管中，加入2L的限制性内切酶，再加入5L反应酶切缓冲液，加入灭菌水，使酶切反应体系达到50L。在37C恒温水浴保温反应3h。将酶切反应
14、液与上样缓冲液泪合后加入预制好的含质量分数为2.5%的琼脂糖凝胶的一个泳道中，进行电泳分析及凝胶成像。6.6 PCR扩增产物测序必要时，对PCR产物酶切检测阳性结果进行PCR扩增产物测序。6.6.1 PCR扩增产物的纯化将60LPCR反应液与上样缓冲液混合后，加入预制好的含质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶的泳道中，在其中的一个泳道中加入DNA分子量标记，接通电源进行电泳。在凝胶成像仪或紫外透射仪下将特异性扩增条带切割下来，以下步骤按凝胶回收纯化试剂盒说明进行。6.6.2 测序扩增反应反应体系(20L):8LDNA测序试剂，200ng500 ng PCR纯化产物，3.2pmol引物，水补足至20L
15、;PCR扩增程序:96.C10 s , 50.C 5 s , 60.C 4 min，25个循环，扩增产物4.C保存。6.6.3 测序扩增产物的纯化扩增管中加入16L水、64L体积分数为95%的乙醇，稍混匀，室温放置15min , 12 000 r/min离心20min，去上清，加入250L体积分数为75%的乙醇，短暂混匀，12000 r/min离心10min，去上清，室温干燥。6.6.4 测序纯化产物中加入170L甲酷胶溶液，95.C, 5 min，迅速转移至冰上，2min。分装样品测序仪的加样槽中，自动测序。6.6.5 测序产物拼接用正向和反向引物分别进行测序扩增反应、纯化和测序，将两次测得
16、序列进行拼接，得到最终PCR产物测序结果。7 结果分析和表述7.1 PCR扩增产物电泳结果牛源性成分的PCR扩增产物为271bp;羊源性成分的PCR扩增产物，绵羊为295bp，山羊为294 bp。7.2 限制性内切酶酶切产物电泳结果PCR扩增产物Sau3AI限制性内切酶酶切产物:牛源性成分为57坤、214bp;绵羊的为91bp、204 bp;山羊的为92bp、202忡。GB/T 20190-2006 7.3 序列比较PCR扩增产物测序结果与附录A牛羊特定的DNA序列进行比较。7.4 结果表述PCR扩增产物电泳检测结果阴性，未检出牛或羊源性成分。PCR扩增产物电泳检测结果阳性，限制性内切酶酶切产
17、物片段大小正确，确认含有牛或羊源性成分f酶w产物片段大小不正确，确认不含有牛或羊源性成分。若对酶切结果进行了测序确证，测序结果与附录A牛羊特定的DNA序列的符合程度在90%以上(含90%)，则确证为含有牛或羊掘性成分;结果符合程度在90%以下，则确证为不含有牛或羊源性成分。5 GB/T 20190-2006 附录A(规范性附录)牛羊特定的DNA序列A.1 牛源性成分的PCR扩增产物序列GTAGGCTTGGGAATAGTACGATAAGGGCTACGAGAGGGAGACCTAAAATTACAGGGG TAATAAAAGAGGTAAATAAATTTTCG AAAGATGATAAAAAGGGTC C
18、TAGTTGCGGCATGTCAC A.2.1 绵羊AATGAGTGGGGT AGTATTAATAGC AATTGAAGTAT GGGAAATAATA A. 2. 2 山羊CCCTGCTCA AAATGAGTGGG TAATATTAATG GAGTTGAAGTGO GGGAAATAGTAA 6 GTTTTGAAACTTTTAGTTG 、AGTCATGTTGACGTGT AATA TTTGATGA CON-o白FONH阁。华人民共和国家标准饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法GB/T 20190-2006 国中晤中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销导印张o.75 字数13千字2006年9月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2006年9月第一版* 定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-27978 GB/T 20190-2006
