1、ICS 65.020.20 B 05 喧嚣中华人民共和国国家标准GB/T 29375-2012 马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程Code of practice for in-vitro virus free seed potatoes plantlets breeding 2012-12-31发布2013-06-20实施中华人民共和国国家质量监督检验检菠总局也世中国国家标准化管理委员会。叩中华人民共和国国家标准马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程GB/T 29375-2012 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室1(
2、010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张1字数24千字2013年4月第一版2013年4月第一次印刷 书号:155066. 1-46980定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107前本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国蔬菜标准化技术委员会(SAC/TC467)归口。GB/T 29375-2012 本标准起草单位z内蒙古大学内蒙古马铃薯工程
3、技术研究中心、中国标准化研究院、甘肃爱兰马铃薯种业有限责任公司、定西马铃薯研究所、重庆市薯类脱毒种苗快繁中心、秘鲁国际马铃薯中心北京联络处、四川省凉山州良圆马铃薯种业有限责任公司、内蒙古希森马铃薯种业有限公司、成都科欣农业生物工程有限责任公司、北京辛普劳食品加工有限公司、湖南农业大学园艺学院、东北农业大学农学院、华南农业大学园艺学院、云南省宣威市马铃薯种薯研发中心、福建省农业科学院作物研究所、问北省郑州市蔬菜研究所、云南省丽江市农业科学研究所、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、内蒙古铃田生物技术有限公司。本标准主要起草人E张若芳、杨丽、周爱兰、孙清华、吴蕾、社密茹、巩秀峰、王义、宋荣庆、
4、李进福、黄振霖、谢开云、严欣、王官茂、陈涛、曲仁山、熊兴耀、玉凤义、曹先维、展康、汤浩、吴焕章、王绍林、罗其友、李文刚。I GB/T 29375-2012 马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程1 范围本标准规定了马铃薯茎尖脱毒与组织培养、脱毒试管苗扩繁的技术要求和操作规程。本标准适用于马铃薯脱毒试管苗的培育、扩繁。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。GB 18133-2000 马铃薯脱毒种薯3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 叶原基leaf primor
5、dium 在茎尖生长点的基部形成的突起。3.2 茎尖stem tip 芽顶端部分(0.1mm-10 mm)其中包括分生组织(0.05mm-0.1 mm)及芽原基和正在发育的叶原基，3.3 茎尖分生组织meristem 茎部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群.3.4 离休培养in-vitro propagation 从植物体分离出符合需要的器官、组织、细胞、原生质体等，通过元菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。3.5 脱毒苗in-vitro virus free plantlet 经检测确认不带马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马
6、铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的试管苗。3.6 核心苗core plantlet 通过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒，经试种观察具有原品种典型性状的脱毒苗。3.7 基础苗basic plantlet 由核心苗繁殖的、经检测无病毒的脱毒苗。1 GB/T 29375-2012 试管苗生产车间4 布局原则脱毒苗生产车间布局应遵循方便消毒、减少污染的原则，遵守操作流程。周围应无污染源，与大田生产隔离。要具备更衣室、清洗室、配制室、灭菌室、无菌贮存室、接种室、培养室等，各房间应隔离。生产环境应清
7、洁、干燥，具有可提供克足自然和人工光源的组培室、车间或生产线。4. 1 / 飞 、/、一回1试管苗生产事间布局平面示意圈二VL/回设备均参见附录AD布局平面示意图因设备、4.2 4.3 4.4 4.4. 1 接种室、培养应保持卫生，定期消毒，每周至少消毒一次。按照J4列的原醒和高镜酸饵2: 1 的比例，40%的甲醒瞅叩问?高锺酸饵容器时号放啡进行熏蒸。密闭1d 后，通风。号-二三-一二/ 4.4.2 接种前接种室应强制过滤通战争二叮卢/4.4.3 每次使用超净工作台前，应提前20mn打开紫外灯二接种时关闭紫外灯打开风机，超净工作台面及内壁用75%乙醇擦拭消毒。4.4.4 操作使用的所有工具，使
8、用前应灭菌。操作过程中慑子、剪刀、解剖刀等工具，每次使用前接触植物材料的部分应灼烧消毒或插入高温灭菌器中灭菌，冷却后使用，避免交叉污染，4.4.5 工作人员应穿消毒工作服，用肥皂洗净双手，操作过程中，手和工作台面要经常用75%的乙蹲清擦。4.4.6若将温室作为培养室，在温室配备有降温水帘和风机，水帘外进风方向应加孔径0.247mm (60目网纱。温室内门口有缓冲间，在缓冲间应有消毒装置，可放人生石灰或其他消毒剂，工作人员进入时鞋底消毒。4.4.7 发现污染及时清除.2 5 茎尖脱毒与培养5. 1 脱毒材料的选取5. 1. 1 田间选择G/T 29375-2012 5. 1. 1. 1 在土壤肥
9、力中等的地块，于现蕾期至开花期选择生长势强、具备原品种典型性状的健康植株，做好标记。5. 1. 1.2 生育后期到收获期，在已做标记的植株中进行薯块复选。选择无病斑、虫蛙、机械损伤而且皮色、肉色、薯形、芽眼等性状符合品种特征的幼龄薯，清洗泥土后催芽作为脱毒材料z或选取健康且具备品种典型性状植株的中、下部短枝茎尖或腋芽进行茎尖剥离。5.1.2 病毒检测筛选人选的块茎或植株，按照GB18133-2000中附录B的方法检测类病毒(PSTVd);按照GB18133 2000中附录A的方法检测病毒。筛选元类病毒(PSTVd)的块茎或植株作为茎尖脱毒基础材料z若检测到没有带病毒的块茎或植株，可直接剥较大的
10、茎尖。其后可不经试种观察直接进行扩繁培养。5. 1.3 催芽处理和病毒钝化5. 1.3. 1 块茎可通过自然方法出芽或通过人工方法(用1.%硫腮十5mg/L赤霉素的溶液漫种5min) 打破休眠催芽。5. 1. 3. 2 自然出芽的情况下，块茎长出2cm3 cm的新芽。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于37 c士1C培养箱中处理3周4周，钝化病毒。5. 1. 3. 3 人工打破休眠催芽的情况下，可采用0.1.%多菌灵溶液浸泡30min或75.%乙醇喷湿进行表面消毒，置于25c黑暗条件下催芽s或播种于含水量20.%灭菌细沙中发芽(水中含5mg/L多菌灵)，块茎长出2cm3 cm的新芽。对含有S病毒、
11、X病毒的块茎需置于37c士1C培养箱中处理3周4周，钝化病毒。5.2 茎尖培养5.2. 1 茎尖培养基的制备5.2. 1. 1 茎尖培养基配方参见附录B.5.2. 1. 2 将制备好的茎尖培养基快速分装于容器中，用封口膜封口。5.2. 1. 3 将盛有培养基的容器整齐排列于灭菌锅内，1.1kg/cm2、121c高压灭菌20min，冷却后在元菌贮存室放置3d5 d，元污染的培养基放到超净工作台备用。5.2.2 材料消毒取经催芽处理和病毒钝化处理的块茎的顶芽、2cm3 cm的侧芽，剪去外叶，用自来水冲洗30min 后，移人接种室进行严格消毒。先用75.%乙薛浸泡30s，再用50g/L的漂白精液浸泡
12、7min10 min 或0.1.%的氯化录榕液浸泡5min10 min，然后用无菌水冲洗4次5次。5.2.3 茎尖剥离与接种接种在超净工作台上操作。剥去外叶，借助40X双目解剖镜，剥离茎尖直至露出半圆形光滑生长点，用解剖刀或解剖针从O.1 mmO. 3 mm处切，带1个2个叶原基。迅速接种于盛有茎尖培养基的容器中，进行离体培养。用酒精灯炜干容器口并封口，在容器上注明编号、品种名称、接种时间.3 GB/T 29375-2012 待看到明显伸长的小茎、叶原基形成可见的小叶时，转移到盛有MS培养基(配方参见附录C)的容器内培养，培养成带4个5个叶片的试管苗.5.2.4 培养条件试管苗在温度20C25
13、 c、相对湿度70%、光照强度2000 lx3 000 lx的条件下培养，光照时数16 h/d。6 病毒检测6. 1 将试管苗按瓶上的编号，在超净工作王军冉将每株的上部主战:-1/2茎段转入新的培养瓶中，编号不变。/石/_-飞卡6.2 同时再将植株下部lt步q/2酶茎段装人病毒检测的梓晶事飞取i哧拌品不能粘有培养基。6.3检测方法按照GB/813YMOO的附录A执行。筛选出不含X、P、PVS、PLRV、PVM、PVA病毒的脱毒苗7 试种观察8 基础苗2C、相对湿度70%、光照强度2000 lx 3 000 lx!6照时数16h/d的条件9 基础苗保存9. 1选择保存培养基配方参见附录b僻-基础
14、且一/ 9.2 将基础苗置于温度13C16 c、相对湿度70%、光照强度3000 lx、光照时数10h/d14 h/d的条件下使其缓慢生长，继代培养出一定数量的脱毒苗保存。10 扩繁10. 1 常规扩篝10. 1. 1 扩繁前检测基础苗是否带病毒(PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM、PVA)和类病毒(PSTVd).检测方法参照第6章执行.10. 1.2 选择用MS固体培养基配方参见附录。或其他扩繁培养基(配方参见附录D)。10. 1.3 将配制好的培养基装入容器中，每瓶加入1/5容量的培养基，用封口膜封口s置于1.1 kg/cmz 灭菌锅121c高压灭菌消毒20min，取出后放置3d5d
15、待用。GB/T 29375-2012 10. 1. 4 检测合格的基础苗在超净工作台上切段扩繁。将培养容器置于超净工作台上，瓶口用75%乙酶擦拭消毒，用长把慑子取出脱毒苗，按单茎节切段，每个切段至少带1个叶片。10. 1.5 操作时将剪下的切段腋芽朝上插入培养基上，用酒精灯烘炜瓶口，用封口膜封好，注明编号、品种名称、接种时间。10. 1.6 培养条件为z白天23c 25 C，夜间16c -20 C，光照强度2000 lx-3 000 lx，光照时数16 h/d，培养21d-25 d. 10. 1.7 待长出7片-8片叶片后可再次切段繁殖。脱毒苗一般间隔25d左右继代繁殖一次。10.2 水培扩繁
16、10.2. 1 在温室中培育。培养基/卫佳丽S液体培养基.飞飞-10.2.2 使用1cm厚的泡捧艇做支撑扭.密度娃h皿Xcm打击NL径为0.7mm. 10.2.3在切转操作时苗曲兢及基部剪掉，剪成带在和冲峭的茎段插入泡沫板中培养。也养。至株高6cm / /7: 川i仨二/ / , 已、5 GB/T 29375-2012 酣录A资料性附录组培设备、试剂A.1 配制室A. 1. 1 防酸碱台面的试验台。A.1.2 冰箱。A. 1.3 药品柜。A. 1. 4 器械柜。A.1.5 分析天平、0.1g感量天平、电子天平。A. 1. 6 酸度计。A. 1. 7 蒸锢水器。A.1.8 各种规格的容量瓶、细口
17、瓶包括棕色、广口瓶、移液管、烧杯、量筒、玻璃棒、吸管、吸耳球、试剂勺等。A.1.9 大量的试管、锥形瓶及罐头瓶.A. 1. 10 不锈钢锅。A. 1. 11 电磁炉。A.2 清洗室及灭菌窒A.2.1 寝泡洗涤水槽和冲洗水槽，A.2.2 培养瓶控水架。A. 2. 3 300 c烘箱。A.2.4 高压灭菌锅。A.2.5 封口膜、线绳或橡皮筋。A.3 接种窒A.3.1 超净工作台，A.3.2 空调。A. 3. 3 培养基存放架。A.3.4 紫外灯。A.3.5 酒精灯。A.3.6 慑子、剪刀、手术刀、解剖针、解剖刀。A.4 培养童A.4.1 有日光灯光源的培养架。A.4.2 紫外灯若干。A.4.3 空
18、调。G/T 29375-2012 加湿机。温、湿度仪。A.4.4 A.4.5 飞飞役军吨A忖衅嬉瞟阶划、D泛酸钙、奈乙酸(NAA)。 : J/;/ /二I 剂试有所的回/忡1药晶甲醒。氯化录。高锺酸饵。漂白粉饱和溶液。75%乙醇，激动素、巧|噪乙酸。pH试纸。卡拉胶、琼A.5.9 蔚糖、食A.5.10 附录/h / A.5.4 A.5.5 A.5.6 A.5.1 A.5.2 A.5.3 A.5.7 A.5.8 A.5 7 、二三飞GB/T 29375-2012 母液成分化学试剂硝酸饵(KN03)大硝酸镀(NH，N03)量氯化钙(CaClz.2HzO) 7G 素硫酸缓(MgSO，. 7Hz 0)
19、 磷酸二氢仰(KHzPO.)铁硫酸亚铁(FeSO，. 7Hz 0) 附录B资料性附录茎尖培养基配方表B.1MS(1962)a 1900 mg/L 1650 mg/L 440 mg/L 370 mg/L 170 mg/L 27.8 mg/L 盐乙二胶四乙酸二销(Naz EDTA) 37.3 mg/L 硫酸锺(MnSO，.4凡0)22.3 mg/L 副酸(H3BO.)6.2 mg/L 微硫酸铸(ZnSO.4凡0)8.6 mg/L 量确化饵(Kl)0.83 mg/L 7G 素硫酸铜(CuSO，.5HzO) 0.025 mg/L 氯化钻(CoClz 6比0)0.025 mg/L 钥酸铀(Na2MoO,
20、 . 2Hz 0) 0.25 mg/L 烟酸0.5 mg/L 肌酶100 mg/L 有硫酸盐腺瞟岭机泛酸钙成分甘氨酸2.0 mg/L 盐酸硫胶素维生素t)0.5 mg/L 盐酸毗哆素维生素s)0.5 mg/L 生物素激激动素0.04 mg/L-素1. 0 mg/L 吗!噪乙酸1 mg/L-3. 0 mg/L 糖黯糖30 g 其他琼E旨6 g a茎尖培养基为MS培养基加激素.b联合国粮农组织推荐的茎尖培养基配方.e国际马铃薯中心的茎尖培养基配方.8 质量浓度FA0(1986沪CIP 1900 mg/L 1900 mg/L 1650 mg/L 1650 mg/L 440 mg/L 440 mg/L
21、 500 mg/L 370 mg/L 170 mg/L 170 mg/L 27.8 mg/L 27.8 mg/L 37.3 mg/L 37.3 mg/L 0.5 mg/L 22.3 mg/L 1. 0 mg/L 6.2 mg/L 1. 0 mg/L 8.6 mg/L 0.01 mg/L 0.83 mg/L 0.03 mg/L 0.025 mg/L 0.025 mg/L 0.25 mg/L 1. 0 mg/L 0.5 mg/L 100 mg/L 100 mg/L 80 mg/L 0.25 mg/L , 0.5 mg/L 2.0 mg/L 2.0 mg/L 1. 0mg/L 0.5 mg/L 1.
22、 0 mg/L 0.5 mg/L 0.2 mg/L 20 g 30 g 8 g 6 g F 母液成分大量元素微量元素铁盐有机成分化学试剂硝酸镀(NH.N03)硝酸御(KN03)氯化钙(CaClz 2Hz 0) 硫酸缓(MgSO.7日zo)磷酸二氢何(KHzPO，)殃化何(KI)珊酸(H3B03)硫酸锺(MnSO. 4Hz 0) 硫酸铸(ZnSO. 7HzO) 铝酸销(NazMoO，.2日20)硫酸铜(CuSO， 5比0)氯化钻(CoClz.6HzO) 硫酸亚铁(FeSO. 7H20) 附录C(资料性附录MS培养基配方表C.1乙二胶四乙酸二销(Na2 EDTA. 2Hz O) 肌障烟酸盐酸毗哆素
23、(维生素B6)盐酸硫胶素(维生素t)甘氨酸GB/T 29375-2012 质量浓度/(mg/L)1650 1900 440 370 170 0.83 6.2 22.3 8.6 0.25 0.025 0.025 27.8 37.3 100 0.5 0.5 0.1 2.0 注1:MS团体培养基为MS培养基+30g/L藤糖+琼脂6g/L(卡拉胶4.5g/L) ，pH为5.6-5.8.注2:铁盐母液的配制z两种试剂分别称量并分别加热溶解，待两种试剂均溶解后混合，混合后的榕液继续加热使其充分整合，冷却后定容备用.9 G/T 29375-2012 母液成分大量元素微量元素铁盐其他附录D(资料性附录)扩繁培
24、养基配方表D.1化学试剂硝酸饵(KN03)硝酸镀(NH.N03)磷酸二氢铮(KH2PO.)氯化钙(CaC12.2HzO) 硫酸镶(MgSO. 7H20) 跚酸(H3B03)硫酸锺(MnSO.4HzO) 铝酸销(Na2MoO.2HzO) 硫酸铸(ZnSO.4比0)破化锦(KI)硫酸铜(CuSO.5日20)氯化钻(CoClz.6H20) 硫酸亚铁(FeSO. 7Hz 0) 乙二胶四乙酸二销(Na2 EDTA. 2HzO) 葳糖倍力凝注1:本配方pH为5.6-5.8.注2:可用卡拉胶或琼脂替代倍力凝.质量浓度1900 mg/L 1650 mg/L 170 mg/L 440 mg/L 370 mg/L
25、 6.2 mg/L 22.3 mg/L 0.25 mg/L 8.6 mg/L 0.83 mg/L 0.025 mg/L 0.025 mg/L 27.8 mg/L 37.3 mg/L 25 g/L 4.5 g/L-5 g/L a铁盐母液的配制=两种试剂分别称量并分别加热溶解，待两种试剂均溶解后混合，混合后的溶液继续加热使其充分整合，冷却后定容备用.10 唱，吨A腼、., -母液成分大量元素微量元素铁盐有机成分其他附录E(资料性附录保存培养基配方囊E.1化学试剂硝酸饵(KNOa)硝酸镀(NH.NOa)磷酸二氢御(KH2PO.)氯化钙(CaCh 2H20) 硫酸镶(MgSO. 7H20) 砌酸(Ha
26、BOa)硫酸锺(MnSO. 4H20) 铝酸销(Na2MoO.2H20) 硫酸铮(ZnSO. 4H20) 碟化饵(KD硫酸铜(CuSO.5日20)氯化钻(CoC!a.6比0)硫酸亚铁(FeSO. 7H20) 乙二胶四乙酸二销(Na2 EDT A 2H20) 盐酸毗哆素维生素B盐酸硫胶素(维生素B1)甘氨酸烟酸生长抑制剂倍力凝藤糖注1:本配方pH为5.6-5.8.注2:可用卡拉胶或军事脂替代倍力凝.GB/T 29375-2012 质量浓度1900 mg/L 1650 mg/L 170 mg/L 440 mg/L 370 mg/L 6.2 mg/L 22.3 mg/L 0.25 mg/L 8.6
27、mg/L 0.83 mg/L 0.025 mg/L 0.025 mg/L 27.8 mg/L 37.3 mg/L 0.5 mg/L 0.4 mg/L 2.0 mg/L 0.5 mg/L 6.0 mg/L-8.0 mg/L 4. 5 g/L-5 g/L 25 g/L NFONlRgNH阁。GB/T 29375-2012 附录(资料性附录壮苗培养基配方F MS+30 g/L食用白糖，液体培养，pH5.8. MS双倍大量元素+微量元素+30g/L食用白糖，液体培养，pH5.8. F.3 MS元机成分十0.4mg/L维生素+30 g/L食用白糖+4.2g/L卡拉肢+5.0 mg/L8. 0 mg/L 维生素鸟，pH5.8. F. 1 F.2 . tJ 咱. . 侵权必究* nu-0。nn phUE A丛E-嘈-AE. 。au nu pa zdE ZA-. 号一价书一定版权专有18.00 G GB/T 29375-2012 打印日期:2013年5月7日F002A
