1、ICS 7104040：7104050G 04 圆雷中华人民共和国国家标准GBT 166312008代替GBT 16631 1996高效液相色谱法通则General rules for high performance liquid chromatography2008-06-1 8发布 2009020 I实施宰瞀髅鬻瓣訾雠瞥篓发布中国国家标准化管理委员会促1”GBT 166312008目 次前言-。1范围-。2规范性引用文件3术语和定义4高效液相色谱法概述一5水、试剂和溶剂一6取样及预处理的操作7仪器配置8洗脱剂9色谱柱和柱填料10仪器安装的环境要求和安全11测量和试料的制备12分析步骤一1
2、3定性分析14定量分析-15分子量分布的测量16制备型液相色谱法17数据质量的保证一18专项标准中涉及的项目-附录A(资料性附录)本标准章条编号与JIS K 0124 2002章条编号对照I05008加n坨HMM掩均均n孙前 言本标准修改采用日本工业标准JIS K 0124本标准根据JIS K 0124 2002重新起草。2002章条编号的对照一览表。GBT 1663120082002(高效液相色谱法通则(英文版)。在附录A中列出了本标准章条编号与JIS K 0124考虑到我国国情，本标准与JIS K 0124 2002的主要差异如下：引用了我国国家标准GBT 9008-2007(本标准第2章
3、)；删除了GBT 9008-2007中已有的术语和定义(本标准第3章)；对试剂和溶剂规格分别进行了规定(本标准的52和53)。本标准代替GBT 166311996(柱液相色谱分析法通则。本标准与GBT 166311996相比主要变化如下：删除了1996年版标准的资料性附录附录A、附录B、附录c、附录D，附录E、附录F、附录K、附录M、附录N、附录P；增加了第3章“术语和定义”、第5章“水、试剂和溶剂”、第6章“取样及预处理的操作”、第16章“制备型液相色谱”、第17章“数据质量的保证”和第18章“专项标准中涉及的项目”；修改了标准名称(见1996年版和本版标准的封面)；修改了标准范围(见199
4、6年版和本版标准的第1章)；修改了高效液相色谱法概述(1996年版第3章；本版第4章)；修改了有关仪器配置的规定(1996年版第4章；本版第7章)；修改了有关洗脱剂的规定(1996年版第5章；本版第8章)；修改了有关色谱柱和柱填料的规定(1996年版第6章、第9章；本版第9章)；修改了仪器安装的环境要求和安全要求(1996年版附录G、附录H；本版第10章)；修改了有关测量制备前的准备工作的规定(1996年版第7章；本版第11章)；修改了有关操作过程的规定(1996年版第8章、第10章、附录J；本版第12章)；修改了有关定性分析的规定(1996年版第11章；本版第13章)；修改了有关定量分析的规
5、定(1996年版第12章、附录L；本版第14章)；修改了有关分子量分布的测量的规定(1996年版第13章；本版第15章)。本标准的附录A为资料性附录。本标准由中国石油和化学工业协会提出。本标准由全国化学标准化技术委员会(SACTC 63)归口。本标准由中国石油化工股份有限公司北京燕山分公司、中化化工标准化研究所负责起草。本标准主要起草人：黄铃、徐泽峰、杨建海，魏静。本标准于1996年12月首次发布。高效液相色谱法通则GBT 1663120081范围本标准规定了使用高效液相色谱法进行的定性定量分析和提纯精制的通用规则。本标准适用于使用高效液相色谱法对无机、有机化合物的定性定量分析及提纯精制，以及
6、对高分子化合物的分子量的测定的一般要求。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 9008液相色谱法术语柱色谱法和平面色谱法3术语和定义GBT 9008确立的以及下列术语和定义适用于本标准。31高效液相色谱仪high performance liquid chromatograph进行高效液相色谱分析的仪器。32分析物analyte样品或样品溶液中存在的待分析的
7、目标组分。33样品溶液sample solution样品溶解在其中的溶液或提取用于分析的溶液。34试样溶液test sample solution用于测试的样品溶液本身或预处理过的样品溶液35泵pump驱动流动相(洗脱剂)的设备。36自动进样器automatic sample injector，auto sampler自动将试样溶液接连地注射进到液相色谱仪的柱子中的设备。37柱箱column compartment色谱柱置于其中的容器。38色谱柱管chromatographic tube柱填料被填充在其中的圆形柱管，其两端装配有过滤器等部件。1GBT 166312008393103113123
8、133143153163173183192对称因子symmetry factor表征色谱峰的对称程度的因子。由下列方程得到：S：=W。05一2f式中，S对称因子；w。；。从峰基线测得的120峰高处的峰宽度；，从峰顶点向记录纸的水平轴划垂直线，与W。m峰宽线相交，峰的前侧的距离定义为，；Wo。；。和，单位相同。柱前衍生化precolumn derivatization，precolumn labeling样品组分在进到色谱柱之前，与衍生试剂反应进行衍生化的过程。柱后衍生化postcolumn derivatization，postcolumn labeling样品组分在色谱柱分离之后，加衍生试剂
9、到洗出液中进行衍生化的过程。标准溶液reference solution其特征值如浓度或分子量是已知的并确定足以用作液相色谱分析的标样的溶液。分离模式separation mode主要由液相色谱分离机理进行分类的操作模式。稀释标准溶液diluted reference solution被稀释成一定浓度的标准溶液。混合标准溶液mixed reference solution通过混合一种以上标准溶液或稀释标准溶液制备的含规定浓度样品组分的溶液。内标物 internal standard内标法中用作标样的物质。分子量分布molecular weight distribution与分子量有多分散性的化
10、合物有关。表示了各种分子作为分子量函数的量。分级fractionation通过色谱柱分离和洗脱取得分析物的操作。流分 fraction通过分级操作分离得到的溶液。320方法确认method validation证明使用高效液相色谱的分析方法适合分析目的的各种测试。4高效液相色谱法概述GBT 1663卜一200841液相色谱法(Lc)是一种具有下述特征的物理和化学分离分析方法。它使用液体作为流动相，每种分析物在色谱柱的固定相和流动相间的相互作用存在差别，这种差别被利用来分离混合物。流动相被加压传送以取得短时间内的高效分离的液相色谱分析方法被称为高效液相色谱法(HPLC)。用于高效液相色谱法的设备
11、被称为高效液相色谱仪。42 LC可应用于测定非挥发性或者热不稳定性化合物，这些化合物难于用气相色谱法测定。因为LC的扩散速度比气相色谱法慢，所以其分离能力比气相色谱法差。虽然LC的分离能力没有气相色谱法高，但是它具有优良的定量能力和容易得到分离的化合物的流分的特点。LC不仅可应用于一般有机化合物，而且也可应用于离子化合物、天然产物、聚合物以及其他广泛领域。43通过综合分析高效液相色谱法所使用的固定相和流动相，可以认识其各种分离机理。表l列出了高效液相色谱法的分类及其分离机理的特点、典型柱填料及其用途。表1 HPLC：分类和分离机理特点、典型柱填料及其用途分离机理 特 点 典型柱填料 用 途分配
12、色谱(包括反相分配 分离是基于固定相和 范围从低分子量到色谱、正相分配色谱以及反 流动相间分配平衡。 化学键合型硅胶(ODS，各种柱填料和各种流 NH等)、多孔幕合物等 高分子量物质的分离。相离子对色谱) 同系物的分离动相的结合应用广泛分离是基于溶质在无机氧化物固定相上的吸附 硅胶、氧化铝、二氧化钛、 极性化合物和异构吸附色谱 平衡。 碳等 体的分离非极性有机溶剂用作流动相分离是基于聚合物填 蛋白、酶等的分离尺寸排阻色谱(分子筛分 料窄孔的分子筛分。 葡聚糖凝胶，琼脂糖凝 纯化及脱盐(亲水聚合物色谱、凝胶过滤色谱、凝胶 操作条件温和。 胶，聚苯乙烯凝胶，聚甲基 填料)。亲水聚合物填料和合 合成
13、聚合物的分子渗透色谱) 丙烯酸酯凝胶等成的聚合物填料有不同 量分级(合成聚合物填应用 料)分离是基于离子交换离子交换色谱(包括离子 剂和离子溶质问的静电相 离子交换树脂 离子型物质的分离排斥色谱和离子色谱) 互作用。 分析，脱盐，盐交换应用广泛分离是基于衍生自生 生理活性物质的浓亲合色谱 物组织的分子识别能力。 酶、肽、糖等组合 缩、分离和精制选择性极高44 HPLC的基本配置如图1所示。HPLC由下列部件组成：流动相提供单元(液体泵)、进样器、色谱柱和柱箱、检测器、数据处理机和记录仪。流动相的流速由泵设定，一定体积的流动相被传送到进样器，再到色谱柱。泵输送流动相的流速范围通常在001 mLm
14、in 10 mLmin。常用往复式柱塞泵(见图2)。当使用梯度洗脱法时，使用14个单元泵或者一个梯度器。GBT 166312008进样器色谱柱 检测罂图1 14-PLC的基本配置(示意图)图2往复式柱塞泵的基本配置(示意图)45通常用微量注射器量取一定体积的样品溶液，注入进样阀，扳动阀钮将样品溶液注入色谱柱。有时使用自动进样器按序列自动进多个样品。46 HPLC使用的柱填料具有相对均匀的颗粒尺寸，粒径一般在1 pm20 pm之间，填料被装填在内径1 mm12 mm的不锈钢或塑料的色谱柱管中，柱长一般几十厘米或者更短。填料的粒径和柱子的尺寸根据其用途而有所不同。47分析物被色谱柱分离，然后基于其
15、物理、光学、电、化学及其他特性被检测器检测。HPLC的典型检测器是紫外可见光检测器。通常这种检测器的流通池体积在4 p-L20 pL之间，它测量被分离后的分析物在一定波长下的吸光度(吸收强度)。其他检测器包括示差折光指数检测器、荧光检测器、电化学检测器、电导检测器、质谱仪等。HPLC使用的典型检测器的特点列于表2。当需要选择性检测或gL量级以下的高灵敏度检测时，依赖于分析物特征使用不同的检测器。表2 HPLC使用的典型检测器及其特点最小检测检测器 选择性 温度的影响 流速的影响 梯度洗脱灵敏度g吸光度检测器(UVVIS检测器) 10 1。 有(吸光物质) 小 无 可用荧光检测器(FLD) 10
16、一” 有(荧光物质) 有 无 可用示差折光检测器(RID) 10-7 无 有 无 不可用电化学检测器(ECD) 1012 有(氧化还原物质) 有 有 可用电导检测器(cD) 101。 有(离子) 有 有 不宜质谱(Ms) 1012 无 有 有 可用48如果分析物不能直接检测或者高灵敏检测不可能实现，则可使用柱前衍生化或柱后衍生化。前者4GBT 166312008是分析物在进到色谱柱之前进行的衍生化，而后者是分析物被色谱柱分离之后衍生试剂同洗脱液进行混合进行的衍生化。49检测器得到每个分析物的响应并转化成电信号，然后送到数据处理机。记录检测器得到的信号对时间作图得到如图3所示的色谱图。数据处理机
17、基于得到的色谱图进行各种参数运算，对分析物进行定性定量分析。当使用保留值对分析物进行定性时，用其保留值(保留时间等)同相同条件下的标准样品的保留值进行比较。当使用质谱或二极管阵列检测器对分析物进行定性时，用分析物的谱图同标样的谱图进行比较。当进行定量分析时，从色谱图得到峰面积值或峰高值，将其代人由含分析物的标准溶液制得的标准曲线进行定量测定。410另一方面，也有可能通过收集与色谱图上色谱峰相对应的流出液对分离的分析物进行等分收集，进行提纯，即制备型液相色谱法。保留体积(保留时问)图3色谱图和每个参数的名称5水、试剂和溶剂51水本标准使用的水应是通过蒸馏或离子交换等方法精制的水，或者通过反渗透、
18、蒸馏、离子交换等方法结合精制的水。水质不应干扰分析。52试剂试剂应是分析纯试剂或质量更好的试剂。试剂不应干扰分析。53溶剂溶剂应是HPLC级的产品或质量相当或更好的产品。它们不应干扰所使用的检测器的性能。6取样及预处理的操作高效液相色谱分析要求按样品的分析目的选择合适的取样方法。根据样品形式和分析目的，样品可直接进高效液相色谱仪，或者对分析物进行萃取、衍生、浓缩等预处理。61取样取样应根据分析目的、样品性质及测试项目使用最佳方法进行，考虑具有样品代表性及能区分每个样品特征的差异。如果有专项标准，则按该标准进行取样操作。为了防止由于老化之类的外部因素引起的变化，预处理和进样的过程应尽可能快地进行
19、。如果样品需要贮存，要预先确认样品不会因为贮存和转移运输发生变化。如果在初步试验和实际测定时样品量和分析物浓度存在较大差别，则设定的条件将无效。如果怀疑样品发生了变化，则要采取相应对策”。用于取样和样品贮存的容器和器具不应含1)例如，生物样品分析物可能被酶和微生物分解，或者被代谢产物和增殖污染。在这样的情况下，应采取诸如添加防腐剂、低温贮存、调节pH值、过滤、热处理、干燥等对策。防腐剂可能影响分析物和色谱图，应引起注意。5GBT 166312008有任何吸附样品或溶解于样品的物质。贮存容器应贴上必要的警示标签。如果为了保证数据的可靠性需要进行重复测定，则相同样品必须同时在两处或两处以上的取样点
20、抽取。62预处理样品在进高效液相色谱仪之前，应针对分析目的、样品性质和测试项目使用最合适的方法进行预处理。预处理一般可改善特性、精密度、灵敏度等，消除测量的干扰物质，保护色谱柱和仪器免予损坏，简化测定操作过程，以及使分析物保持稳定。预处理包括下列过程：称重、蛋白质脱除、萃取(液液萃取、固相萃取、溶剂蒸馏、超滤分离、超i瞄界流体萃取等)、净化(液液萃取、固相萃取等)、脱水、脱盐、浓缩、定容、衍生、标准物加入、溶剂调整(衍生化、溶解在适于进样的溶剂中)等等。如果有专项标准，则按该标准进行预处理。如果加入内标物，在色谱图上内标物应与样品基质很好地分离。其保留时间应与目标组分的保留时间差别不大。如果使
21、用质谱，与内标物的分离不一定是必需的。样品应溶解在少量其淋洗能力等于或小于流动相的溶剂中。溶剂可能影响稳定性和目标组分的分离，因此应谨慎选择。必要时，使用02tra05 p-m的过滤膜对样品进行过滤以除去不溶物。预处理有可能引起来自试剂、容器、环境等的污染，引起杂质的混入以及分析物的损失，应引起注意。7仪器配置71流动相供应单元输送流动相(洗脱剂)到色谱柱的供应单元，主要由下列部件组成：711洗脱剂储液器洗脱剂储液器应使用不影响流动相(洗脱剂)化学组成的材料制成。洗脱剂储液器应防止在使用过程中环境因素对流动相的污染，如蒸发变质等。712脱气器脱气器被用来连续脱除溶解在流动相(洗脱剂)中的空气，
22、以免由于仪器内温度压力变化引起的气泡问题，从而保证稳定的流速和信号背景。713供液泵以精确流速将流动相(洗脱剂)输送到色谱柱的泵必须满足下列要求：a)流速范围宽；b)流速精度高；c)流量脉动低；d)在较宽的压力范围内具有稳定的输液能力；e)与液体接触的材料具有优异的化学惰性；f)易于更换流动相。714梯度洗脱单元梯度洗脱单元由控制器和混合器组成，控制器可以连续改变混合流动相(洗脱剂)的组成而混合器将获得均匀的混合溶液。混合比的设定范围要宽，浓度要精确。72进样器进样器的材料和构造应确保所进的样品没有吸附保留，进样重复性好。如果用自动进样器自动进行许多试样的进样，那么它应具有以下基本功能：重复性
23、、定量进样准确性、保留小、极小的样品量等等。如果有预期的用途需要，则应加上冷却功能，以便增加制备好的样品数量和降低样品组分的分解和蒸发。具有样品预处理功能或柱前衍生化功能的自动进样器也可能用到。73分离单元731色谱柱根据分析目的，使用本标准第9章叙述的色谱柱。从进样器到色谱柱人El的流路和从色谱柱出口6GBT 166312008到检测器的流路应使用死体积尽可能小的管路，以免样品谱带扩散。可使用保护柱来防止分析柱性能损坏。732色谱柱箱使用色谱柱箱可提高分离分析的稳定性从而确保分析精度。色谱柱箱应具有温度控制功能。控制温度可优化色谱柱性能、增强分离选择性以及防止柱温受环境温度变化的影响。74检
24、测器洗脱剂从色谱柱进入检测器的微流池，检测器按照不同原理以流动相作为背景检测分析物的浓度或体积。常用检测器的特点见表2。741吸光度检测器吸光度检测器检测样品组分在紫外可见光区的吸光度。按分析物的吸收特性确定吸收波长。常用的吸光度检测器类型是分光光束通过流动池中的样品组分，到二极管阵列检测器，产生光谱，测量各波长下的吸光度变化。通过使用各波长下的色谱图和每个组分的保留时间可以获得定性分析结果和峰组分纯度的确认。742示差折光指数检测器样品组分的流出引起流动相折光指数改变，这种改变被检测器以折光指数之差进行检测。743荧光检测器荧光检测器检测样品中某个组分受到激发光激发在特定波长下的荧光强度。为
25、了设定最佳波长和定性确认峰组分，有些荧光检测器具有进行激发、激发产生的荧光波长扫描以及荧光光谱采集等功能。744电化学检测器电化学检测器检测样品组分在加有特定电压的工作电极上进行氧化还原反应产生的电流。745电导检测器电导检测器检测流动相溶液和样品组分之间电导的差别。746质谱检测器质谱检测器将从色谱柱流出的样品组分进行离子化，然后按照质荷比检测这些离子。747其他类型检测器其他类型检测器包括下列检测器：a)红外光谱检测器(IR)；b) 旋光度检测器(OR)，圆二色检测器(cD)；c)火焰离子化检测器(FID)；d)放射检测器(RI)；e)介电检测器；f)化学发光检测器(包括生物发光)(CLD
26、)；g) 原子吸收分光光度检测器(AA)；h) 电感耦合等离子体发射光谱检测器(IcP_AEs)；t) 高频等离子体质谱检测器；J)热检测器；k)光散射检测器；1)黏度检测器；m)离子电极检测器；n)超声波检测器；o)核磁共振仪检测器。75数据处理机数据处理机显示色谱图和计算得到的定量结果。计算可通过制备校准曲线，用浓度对保留时间、峰7GBT 166312008高、峰面积等作图。有些数据处理机具有光谱分析功能。76附件根据分析目的，如果必要，应提供下列附件：a)计算机(用于工作站，用于数据处理和仪器控制)b)路径切换阀(柱切换、循环、反冲等)；c)流分收集器；d)柱后反应器。8洗脱剂81洗脱剂
27、的选择应按分离模式或检测模式选择洗脱剂，以满足要求。811要求洗脱剂应满足下列要求：a) 能合适地分离分析物；b)不会化学的或物理的破坏柱填料；c)能溶解样品而没有破坏；d)适合检测器；e)脱除固体物质”；f)脱气”。812按分离模式选择(见表3)表3按分离模式选择洗脱剂分离模式 洗脱剂 备 注己烷、戊烷、二氯甲烷、乙醚、 洗脱剂极性越高，洗脱能力越强。分离选择性随吸附色谱 异丙醇、甲醇，以及其他具有不 洗脱剂的极性改变。除此之外，还随氢键、可受性同极性的有机溶剂，可混合使用 和偶极作用而改变己烷、戊烷、二氯甲烷、乙醚、 洗脱剂极性越高，洗脱能力越强。分离选择性由正相色谱 异丙醇、甲醇，以及其
28、他具有不 分析物在洗脱剂和固定相中的溶解性决定。除此同极性的有机溶剂，可混合使用 之外，还随氢键、可受性和偶极作用而改变洗脱剂极性越低，洗脱能力越强。分离选择性由甲醇、乙腈、THF、和其他有 分析物在洗脱剂和固定相中的溶解性决定。除此反相色谱 机溶剂同水或缓冲溶液混合 之外，还随氢键、可受性和偶极作用而改变。如果分析物是离子型化合物，洗脱剂的pH值将严重影分配色谱 使用 响保留分离。在离子型化合物电离的pH值下，保留很弱，而在非电离的pH值下，保留变强能同要分析的离子形成离子反相离子 对的缓冲溶液被制各，加入疏水 有机溶剂的混合比越大，洗脱能力越强。作为离试剂作为对离子。这样的缓冲子对色谱的洗
29、脱剂，调整离子对试剂浓度和pH值对色谱溶液同甲醇、乙腈、THE*和其他 很重要有机溶剂混合使用82)为了脱除固体物质，洗脱剂通常应通过孔径05 pm或更小的膜进行过滤。如果使用粒径为3tm或更小的柱填料，使用的过滤膜的孔径应是粒径的110。3)如果高效液相色谱仪具有脱气装置，则不必预先脱气。表3(续)GBT 166312008分离模式 洗脱剂 备 注初始洗脱剂是分析物在该pH值下电离的缓冲溶液，分析物被保留。然后，氯化钠和其他碱以梯度缓冲溶液被使用，其缓冲能力 或线性增加添加浓度的方式加人到缓冲溶液中。使得分析物的电荷差别在一定 另外，缓冲溶液的pH值将改变，以便使分析物朝非离子交换色谱 的p
30、H值下最大。通常初始洗 电离方向转化。反之，洗脱剂也可能是在该pH值脱剂的浓度是20 mmolL 下分析物不电离的缓冲溶液，并且分析物可通过只50 mmolL 是移动被分离。如果树脂型离子交换剂被使用，除了离子变换外还可能存在疏水作用、氢键、尺寸排除等。因此，加入有机溶剂可调整分离在羧酸或其他弱酸的情况下，使用水或1 mmolL10 mmolL 一般地，如果分析物被电离，洗脱就快，如果不电离子排阻色谱 的酸的水溶液(pH值为23)。 离，洗脱就慢。通常，洗脱剂的pH值应选择以使分在弱碱性化合物情况下，主要 析物间的电离速度的差最大用水使用的缓冲溶液的pFI值和离 在其中分析物有可能同配体偶合的
31、洗脱剂应同子强度适于分析物和配体相互 色谱柱保持平衡。样品进到色谱柱，然后离子强度亲和色谱 作用。蛋白质等的亲和色谱常 和pH值将改变。这是一种非特定洗脱。另外，游使用三氢氯酸缓冲溶液、磷酸缓 离的过量配体或其相似物质溶液应被使用，这是一冲溶液、醋酸缓冲溶液等 种特定洗脱使用对分析物和柱填料都很亲和且不易受吸附、分配等这些 如果尺寸排阻色谱需要在100或更高温度下不属于排阻色谱分离模式影响 进行，则可能使用TCBb。当溶剂在室温下是固体非水尺寸 的溶剂。在此，聚苯乙烯凝胶被 时，分析后应将柱上保留的溶剂用其他溶质置换。排阻色谱 用作柱填料，则常用THF，因为 溶剂置换时，流速不能超过色谱柱的工
32、作压力。不其具有相近的溶解作用参数。 必要的溶剂置换将缩短色谱柱的使用寿命尺寸排 如果分析物是极性的，可能使用DMF：和其他极性溶剂阻色谱洗脱剂中加入碱以便阻止柱填料和分析物问的静电作用并 如果分析物同柱填料存在疏水作用的可能性，在耐水尺寸 增加离子强度。在蛋白质和其 色谱柱可接受的范围内，可在洗脱剂中加人甲醇或排阻色谱 他样品的情况下，pH值影响稳 其他极性有机溶剂定性和空间构型，可能使用其他合适的缓冲溶液8 THF四氢呋喃；b TCB三氯苯；。DMF二甲基甲酰胺。813按检测器选择(见表4)表4按检测器选择洗脱剂检测器 洗脱剂的选择通常选择的洗脱剂在检测波长下是透光的或只有微不足道的吸收。
33、使用没有紫外吸收的高纯溶剂、水和试剂制备洗脱剂。一般情况下，溶剂在短波长有强的吸收，一些缓冲吸光检测器溶液在紫外区有强吸收，应给予注意。在梯度洗脱的情况下，洗脱剂组成的变化可引起吸收强度的变化，引起基线波动。在检测波长下，使用的所有溶剂必须是足够透光的9GBT 166312008表4(续)检测器 洗脱剂的选择洗脱剂应在激发光波长和荧光波长下都不吸收。使用没有荧光杂质的高纯溶剂、水和荧光检测器试剂制备洗脱剂示差折光指数检测器 洗脱剂的折光指数应与分析物的折光指数有差别。应充分搅拌洗脱剂使浓度差最小电化学检测器 使用电化学惰性的高纯溶剂、水和试剂制备洗脱剂洗脱剂在检测波长下应没有吸收。使用没有发光
34、杂质的高纯溶剂、水和试剂制各化学发光检测器洗脱剂质谱 洗脱剂应该是挥发性的。使用没有杂质的高纯溶剂、水和试剂制备洗脱剂82洗脱剂的制备821混合洗脱剂的制备最适合分离的洗脱剂通常用两种或更多种溶剂充分混合制备。除了尺寸排阻色谱，很少使用单一溶剂。关于混合洗脱剂的制备，应注意以下几点：a) 使用能够完全混合的溶剂；b)充分搅拌以获得均匀组成；c)混合洗脱剂的组成可用室温下混合前的体积比表示。混合洗脱剂的体积不一定等于各溶剂体积的总和。由此，各溶剂的体积应分别测量；d)如果混合时溶液温度改变，应冷却至室温；e)当有机溶剂和缓冲溶液或离子对试剂混合时，如果产生沉淀的可能性很高，应使用孔径05,um或
35、更小的过滤膜进行过滤除去沉淀f)依赖于贮存条件，有些洗脱剂可能容易发生组成变化、化学变化、吸水等。822洗脱剂脱水和溶剂的水饱和如果样品组分遇水不稳定，或者像硅胶或其他一些对水很亲和的物质被用作固定相，应注意洗脱剂中的水分，并且用前应进行脱水。在吸附色谱法中，水分严重影响分离选择性，可使用用特定的水分饱和的溶剂制备洗脱剂。8221洗脱剂的脱水脱水应使用合适的干燥剂。醇类和乙腈可以用3A和4A分子筛脱水。8222溶剂的水饱和将有机溶剂同稍稍多于饱和水量的水混合，在高于使用温度510的温度下充分搅拌，然后在使用温度下搅拌。静置分层后，取有机相层即制得100水饱和的溶剂。将其按一定比例同完全脱水的溶
36、剂混合，即可制得一定饱和度的水饱和溶剂。823洗脱剂的pH值调节方法在反相分配色谱中，可加入少量的酸或碱来调节洗脱剂的pH值，洗脱剂的pH值也可能由于空气中的二氧化碳的溶解作用受影响。如果pH值严重影响分离，必须使用缓冲溶液，缓冲溶液在所用的pH值范围内具有足够的缓冲能力。如果用有机溶剂同缓冲溶液混合制备洗脱剂，混合比将影响氢离子浓度。但是，混合前缓冲溶液的pH值通常应就是洗脱剂的pH值。9色谱柱和柱填料91色谱柱911色谱柱的标记色谱柱多种多样。色谱柱的标记除了柱填料的名称外，还要指明色谱柱管的材料、长度和内径。10GBT 166312008912色谱柱管的材料用作色谱柱管的材料应有足够的强
37、度、有光滑的内表面、对洗脱剂和分析物惰性。例如有不锈钢、聚醚醚酮(PEEK)、玻璃、衬玻璃不锈钢、石英管等。913色谱柱的分类依赖于分析样品的类型、进样量和特点以及分析条件，色谱柱有不同的尺寸。按内径可以将色谱柱分类如下：a)半制备柱：内径12 mm50 ram(不含50 ram)；b)通用柱：内径3 mm12 mm(不含12 mm)；c)半微柱：内径1 mm3 mm(不含3 mm)；d)微柱：内径1 mm以下。92柱填料柱填料通常是相对均匀的颗粒，粒径范围1 pm20 pm，或者是具有同等效果的棒状连续体。填料在工作条件下具有物理化学稳定性。柱填料材料有硅胶类的无机物、聚苯乙烯凝胶类的聚合物
38、，以及用上述材料作母体在其表面上化学键合有机分子的物质。93分离方式和色谱柱填料按照色谱柱填料和洗脱剂的组合，HPLC有多种分离方式。按分析物的化学、物理特性，合理地选择分离方式。94柱性能评价色谱柱条件可用峰型、理论板数、对称因子等参数评价。色谱柱性能以柱寿命、分离能力、选择性、最大样品负荷等参数评价。当评价色谱柱性能时，应在一定条件下进行，这些条件不受环境和仪器影响，保证获得重复性。10仪器安装的环境要求和安全10I环境要求安装高效液相色谱仪的房间一般应满足下列条件：a)温湿度应在仪器规定的范围内且不会突然改变；b)没有震动和阳光直射；c)清洁无尘、无腐蚀性气体，有良好的通风；d)没有强磁
39、场和电场；e) 电源电压、容量和频率符合仪器规定，电压波动在土10以内，没有频率波动；f) 提供接地电阻小于i00 Q的接地点。102安全为安全目的，应注意下列事项：a) 分析使用的样品和化学试剂在处理时应注意其爆炸性、易燃性、毒性或危害性。废液应该按照环保规定，在进行安全和无害化处理后弃置。危险物质和有毒和有害物质应该按照相关法规进行处理o；b)将仪器接地；c) 当使用压力容器内气体时，要遵从相关规定。如果其容器置于仪器附近，则容器应该固定到基座、墙壁、实验台上等等，以免翻倒；d)在操作仪器前，要彻底检查管路、接头等处是否漏液和漏气；4)当处理有毒有害化学试剂时，应穿戴防护服(护目镜、橡胶手
40、套和防毒面具等)。11GBT 1663 12008e)直接接触仪器内部有可能引起电击。在检查和维修”时，应先切断电源；f) 有些检测器使用光源灯，工作时会发射紫外线，因此在维护和更换灯时应戴护目镜。光源灯工作时发热，不得触摸；g)仪器有可能产生电磁干扰，或者受其他仪器的电磁干扰，应给予注意；h)如果直接用手接触生物样品(血清、血浆、组织、尿样等)，有可能引起感染。须小心处理这些样品。要注意防止样品直接接触皮肤。11测量和试料的制备111样品的制备样品进行制备可改善分析物的定性定量精度，稳定分析物不发生变化，保护色谱柱和仪器。样品制备包括：样品溶液的稀释浓缩、样品溶液中干扰物的脱除、样品溶液中加
41、入标准溶液、分析物的衍生化等。样品制备既要改善分析精度，也要提高制备过程的效率。可使用自动进样器、使用高压切换阀的柱切换等方法来自动进行样品制备。如果样品制备的条件有专项标准规定，则按该标准进行。1111样品溶液的稀释或浓缩为了使分析物保持在合适的浓度范围内，应对样品溶液预先进行稀释或浓缩(溶剂萃取、固相萃取等)。在试样溶液制备好后，应尽快进样分析。试样溶液应溶于流动相。1 112样品溶液中干扰组分的脱除如果样品中含有固体组分、对色谱柱有不利影响的组分或者干扰定性定量分析的组分，应使用过滤膜法(用孔径05 pm或更小的膜)、功能膜(超滤膜)法、固相萃取、溶剂萃取等方法制备试样溶液，脱除先前的干
42、扰物质。1 113样品溶液中加入标准溶液当使用内标法时，样品溶液中要加入内标物；当使用标准标准加入法时，样品溶液中要加入标准溶液或稀释标准溶液。因此，试样溶液需要进行制备”。试样溶液制备时可使用混合的稀释标准溶液。1114柱前衍生化如果不能直接检测分析物，或者需要高灵敏性或高选择性检测，或者需要优化分离，可在试样进色谱柱前使试样中的目标成分衍生化。柱前衍生化有两种情形：一种是加入试样溶液中分析物的衍生剂，另一种是加入进行氧化、还原、分解等反应的试剂。柱前衍生化可通过自动进样器具备的功能自动进行，这样的功能包括：加入试剂、混合反应液体、控制反应时间、注射反应液体等”。”2分析检测器的选择HPLC
43、检测器检测从色谱柱流出的流动相中的分析物，完成定性定量分析。检测器各种各样，应根据实际试样选择合适的检测器。一些检测器的类型见74。113柱后衍生化分析物通过色谱柱分离后，衍生试剂、pH值调节溶液等与流出物混合，将其加热、光照或通过像非固定酶色谱柱之类的一个反应器，使其经过衍生反应之后再检测。当由于下述原因而使选择性的、高灵敏的检测成为不可能时才应用柱后衍生，这些原因包括：分析物结构完整不能检测、检测灵敏度低、残余5)如果仪器使用锂电池，不当处理可能引起爆炸。6)加入标准溶液不应在试样溶液中产生沉淀或化学反应，例如形成络合物，这些事先应进行确认。7)依赣于反应参数，如试剂的数量、加人的量、混合
44、作用的次数、反应温度、反应时间等。适宜的柱前衍生试剂是有限的。GBT 166312008物干扰大。114等度洗脱使用单一组成洗脱剂将分析物从色谱柱中洗脱，通常采用单元泵，其特点是具有良好的保留时间重复性。115梯度洗脱梯度洗脱就是洗脱剂组成按时间程序改变，将分析物从色谱柱中洗脱。与等度洗脱相比，梯度洗脱减少了洗脱时间，而且峰型更尖锐。洗脱剂组成可以呈线性、梯度或指数变化。通常有两种梯度洗脱方式：一种是低压梯度洗脱，使用一个单元泵作为输送液体的设备，另一种是高压梯度洗脱，需要多个单元泵。116馏分制备制备色谱的准备工作应满足如下条件：a)用于制备色谱的样品溶液的准备：1)进样溶剂应能溶解样品且不
45、改变分析物的性质。样品应溶饵在溶鳃力等于或弱于洗脱剂的溶剂中；2) 样品溶液中颗粒物和不溶物质应事先通过膜过滤等方法除去；3)样品应先利用溶剂萃取等方法进行粗分。b)洗脱剂的准备：1)洗脱剂对填充物应是惰性的且不影响样品的活性；2)洗脱剂应适合于样品的等分回收；3) 洗脱剂中的颗粒物或灰尘应事先通过膜过滤等方法除去。c)制备色谱装置：1)与液体接触部件的材料，如液体泵、管线和色谱柱管应不被样品或洗脱剂腐蚀，且不应污染样品和洗脱剂；2)设备应足以耐受操作压力；3)相应于所用色谱柱的尺寸和流速，死体积应足够小；4) 检测器的灵敏度应根据进样量进行优化。d)色谱柱的准备：1)填料在操作条件下应当具有
46、物理化学稳定性，由于不可逆吸附和氧化造成目标成分损毁应很小；2)应使用分析柱以小规模研究制备色谱条件，色谱柱应在优化条件下使用；3) 等分制备色谱柱的性能应在预先确定的条件下得到确证。12分析步骤121分析条件的设定以下项目应按专项标准规定的条件进行设定建立：a) 流动相的种类和流速(当使用梯度洗脱方法时，流动相的起始组成、组成变化比、最终组成等的各种程序)b)色谱柱的种类；c)色谱柱的温度；d)检测器的灵敏度；e) 数据处理部分的条件(数据处理机、记录仪)。122基线稳定性的确认当在121所规定的条件下运行时，应确认基线的波动对测定没有影响。】3GBT 166312008123进样使用微量注射器准确量取一定体积的样品，注入进样阀，扳动阀钮快速进样。当使用自动进样器时，设定合适的条件。124分析步骤如使用记录仪，在进样的同时，在记录仪的记录纸上标记进样点。调整衰减
