1、ICS 67. 050 X 04 中华人民共和国国家标准GB/T 20767-2006 牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌盼、己烧雌酣、双烯雌酣残留量的测定液相色谱-串联质谱法Method for determination of zearalanol , diethylstilbestrol, hexestrol and dienoestrol multi-residues in bovine urine- LC-MS-MS method 2006-12-31发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2007-03-01实施发布前本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华
2、人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。GB/T 20767-2006 本标准起草单位:中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人:庞国芳、许凯、林安清、古珑、何佳、张曼。本标准系首次发布的国家标准。I 1 范围牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌盼、己烧雌酣、双烯雌酣残留量的测定液相色谱串联质谱法GBjT 20767-2006 本标准规定了牛尿中玉米赤雌酣残留量液相色i岳串联质谱测定方法。本标准适用于牛尿中本标准的方法检x5(烯雌酣为1.0g/L。2 规范性引用立件J 下列文件中的修改单(不包是否可使用这(
3、GB/T 6379. GB/T 6 性与再现性3 原理免疫亲和舍，形成抗体-抗被用被相色谱-串4 试剂和材料除另有说明外，所4. 1 甲醇z色谱纯。4.2 乙醇:色谱纯。4.3 乙睛:色谱纯。1992 ,neq 分析纯，水为GB/T6682规4.4 淋洗液1将Randox试剂盒1)中提供商霄附制曹惯霄丢离子水按1: 20稀释。|用文件，其随后所有威胁议的各方研究标准。分z总则与定义准测量方法重复:1987) 酣和玉米赤霉醇结物，收集t5t脱破。试4.5 洗脱被:乙回事十水(70十30)。量取70mL乙醇(4.2)与30mL去离子水据合。4.6 储备破:将Randox试剂盒中提供的储备原被用去离
4、子7，1(按1: 5稀释。4. 7 免疫亲和层析柱:Randox或相当者。4. 7. 1 玉米赤毒醇免疫亲和层析柱:亲和柱的最大容量为100ng玉米赤霉醇D4.7.2 二苯乙烯免疫亲和层析柱z亲和柱的最大容量为50ng己烯帷酣，50ng己烧帷酣，50咱1)给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可a如果其他产品能有相同的效果，则可使用这些等效的产品e1 GB/T 20767-2006 双烯雌酣。4.8 激素标准物质:玉米赤每醇(包括r玉米赤霉醇和萨玉米亦霉醇，各50%)，纯度二三97%;己烯雌酣，纯度二三99%;己烧雌酣，纯度二三98%;双烯摊酣，纯度注98%。4.9 激素标
5、准榕破:分别准确称取适量的玉米赤霹醇、己烯雌酣、己烧雌酷和双烯雌酣标准物质，用甲醇(4.1)配制成1.0 mg/mL标准储备榕液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准榕液作为标准工作梅壤，保存于4.C冰箱中，可使用三个月。4. 10 内桥标准物质:玉米赤霉醇-41ft代(包括r玉米赤君主醇47瓦代和玉米赤霉醇-4j瓦代，各50%), 纯度注99%;己烯雌酣-8j页代，纯度注98%。4. 11 内标标准榕破:准确称取适量玉米赤霉醇-4j瓦代和己烯雌酣-8j瓦代标准物质，用甲醇分别配制成l.0 mg/mL标准储备踏破。再以甲醇稀释成适用被度的?昆合内标标准工作溶液，保存于4.C冰箱中，可使用三
6、个月。4. 12 掘膜:孔径0.45m.5 仪器5丘.1 被相色谱但串联质i谱普联用仪:配有大气压化学电离摞。5.2 离必机:转速大于30Oo r旷/min5.3 氮气踉缩仪。啊5.4 涡旋振荡器。6 试样的制备与保存6. 1 试样的制备取有代表性样品，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记。6.2 战样保存将试样置于2.C-8.C下保存。7 测定步骤7. 1 基质混合标准溶班的制备7. 1. 1 样晶称取取5个阴性牛尿样品，每个10mL，于50mL离心管中，3000 r/min离心(5.2)15 mino向5支10 mL试管中，分别加入不同量?昆合标准工作梅液(4.9)
7、，使玉米赤毒醇和己烧雌酣的被度为1. 25 ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、12.5 ng/mL、25ng/mL ;己烯雌酣和双烯雌酣的故度为2.5 ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加入适量混合内标标准溶液(4.11)，使其浓度均为10ng/mL.加人3mL离心后牛尿的上清液，涡旋(5.4)30s潜解，待净化。7. 1. 2 净化用15mL淋洗液(4.4)分两次预洗免疫亲和层析柱(4.7) ，流速不大于3mL/mino上样，自然流速。用5mL淋洗液以不大于2mL/min的速度淋洗，等体积重复淋洗一次，再用5mL去离子水以不大于
8、2mL/min的速度淋愤。用4mL洗脱液(4.5)洗脱，流速不大于2mL/min，收集洗脱液。将洗脱瓶在氯气浓缩仪(5.3)上于400C水恪中吹干，加入1mL流动相，捐旋30s播解。榕液经滤膜(4.12)过撞后，供破相色i普田串联质i曾测定。7.2 试样溶液的制备取经3000r/min离心15min后待测样品3mL于50mL离心管中，加入内标标准工作梅液，使其含量均为2.0g/kgo按7.l. 1和7.l. 2操作。GB/T 20767-2006 7.3 空白基质溶洒的制备取经3000 r/min离心15min后阴性样品3mL于50mL离心管中，按7.1.1和7.1.2操作。7.4 测定7.
9、4. 1 液捆色i曾条件a) 色谱柱:ZORBAX Eclipse S匹马.3.5m，150 mm X 4.6 mm或相当者;b) 柱温:25C ; c) 流动相z乙腊十水(70十30);d) 流速:1. 0 mL/min; 的进样量.50L，7.4.2 质i曾条件的离子化方式:大气压化学电离;b) 扫描方式:负离子扫描pc) 检测方式:多反应监测(MRM); d) 离子掠温度:325C;的算化气压力:0.1035 MPa; f) 气帘气压力:0.069 0 MPa; g) 辅助气压力:0.2415 MP的h) 喷雾器电流:一5p.A; i) 电喷雾电压:-4 500 V; j) 定性离子对、
10、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1，表1四种激素和两种内标物的定性离子对、定噩离子对碰撞气能量和去簇电压药物名称定性离子对Cm/z)32 1. 1/277.2 玉米赤霉醇32 1. 1/303.2 325. 1/208. 9 玉米赤霉醇-4焦代325. 1/263. 1 267.0/222.1 己烯雌盼267.0/237.1 265.0/221. 1 双烯雌盼265.0/235.1 269.0/119.。己:烧雌酣269.0/134.。275.1/227, 9 己烯雌酣-8j瓦代275. 1/245.。7.4.3 施相色i曾串联质谱测定7.4.3.1 定性测定定量离子对(m/z)碰撞气能量
11、/V去簇电压/V-35 -100 32 1. 1/277. 2 -35 -100 一36一100325.1/263.1 -38 -100 一40-90 267.0/222.1 -40 -90 -35 一90265.0/235.1 -32 一90-22 一75269.0/134.。-46 一75-40 一73275. 1/245.。-40 一74每种被测组分选择1个母离子.2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与棍合基质标准校准榕液中对应的相对保留时间偏差在士2.5%之内;样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与被度接近的?昆合基质标准校准榕被谱
12、图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。3 GB/T 20767-2006 相对离子丰度允许的最大偏差7. 4.3.2 定量测定表2定性确证时相对离子卒度的最大允许偏差50 土2020-50 士251020 土3010 士50% 在仪器最佳工作条件下，基质棍合标准榕液(7.1)分别进样，以工作榕液眼皮为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用内标怯进行定量测定。样品溶液中玉米赤璋醇、己烯雌酣、己烧雌酣和现烯雌酣激素的响应值应在工作曲线范围内。在上述色i普条件和质谱条件下，标准物质液相色谱-串联质谱的多反应监测(MRM)色谱图，参
13、见图本方法的添加回收率数据参见7.5 平行试验搜以上步骤，对同7.6 空白试验除不称取试样外8 结果计算式中:X一一-试cs-一基A一一试As-一基Csi一一基质Asi一一基质A; -试样静Vs一一样液最9 精曹度物残留量作梅液中本标准的精密度数据是按照以95%的可信度来计算。9. 1 重复性. ( 1 ) . 2的规定确定的，重复性和再现性的值在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，牛尿中四种激素的含量植围及重复性方程见表3。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2 再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过
14、再现性限R，牛尿中四种激素的含量植围及再现性方程见表3。4 GB/T 20767-2006 表3含量范围及重复性和再现性方程化合物名称含量范围/Cg/L)重复性限俨再现性限R玉米赤霉蹲0.25-5 Ig r=O. 965 6 Ig m-1. 0897 Ig R=O. 962 5 Ig m-O. 712 8 己烯雌盼0.5-10 Ig r=O. 719 2 Ig m-O. 268 5 Ig R=O. 788 3 Ig m-O. 292 6 双烯雌盼0.5-10 Ig=0.531 2 Ig m-O. 312 7 Ig R=O. 750 7 19 m-O. 248 7 己:境雌盼0.25-5 19
15、r=O. 772 8 19 m-O. 418 5 Ig R=O. 869 8 19 m-O. 283 0 注:m为两次测定结果的算术平均值。5 GB/T 20767-2006 附录A(资料性附录)玉米赤霉醇、己烯雌酣、己皖雌酣、现烯雌酣标准物质及玉米赤霉醇-41在代、己烯雌酣-8先代内标物的多反应监测(MRM)色i曾图玉米赤霉醇、己烯雌酣、己皖雌酣、双烯雌酣标准物质及玉米赤霉醇-4J在代、己烯雌酣-87页代内标物的多反应监扭(MRM)色谱圈，见图A.lo在pbzEHZM2.54 2.28 玉米赤霉醇321. 1/277. 2 飞飞tlmin a) 玉米赤霉醇2.54 玉米赤霉酶-4纸代325.
16、 1 / 236. 1 tlmin b) 玉米赤霉醇-41武代1$14It-4 的Eoeh=mEOHE】11| 且昌在EE-一-一一lr 己烯雌盼罚7.0/222.1A._ _ _ .f-一一一(一I/min c) 己烯雌酌2.99 .E4E.1. a且气RhbV苦叩百的吉口E0旦#吉口问L 己炕雌1269.0/134.0 / I min d) 己烧雌盼l14-L aoRb百542 F皇巳A 双问265. 0 / 235. 1 11町1me) 双烯雌酌Iti-L 乱。bzzu扫卫臼1 3.自己烯雌酷-sjt代2盯.1/245.0一一_，4. _一一一-tlmn 。己烯雌酌-8j在代固A.1 玉
17、米赤.醇、己烯雌酣、己蝇雌酣、XR烯雌酣标准物质及玉米赤霉醇-41在代、己烯雌酣-8j在代内标物的多反应监测CMRM)色i曾圈B 附录B(资料性附录)回收率本方法中四种激素添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B.LGB/T 20767-2006 表B.l本方法中四种激素添加浓度及其平均回收率的试验蚊据激素名称添加浓度/(问/L)平均回收率;(%)O. 5 85.30 玉米赤霉醇2. 5 99.29 5.0 96.99 1. 0 80.81 己烯雌盼5. 0 101. 40 10.0 100.20 1. 0 105.20 双烯雌盼5. 0 93.30 10.0 97.50 O. 5 83.74
18、 巳炕雌盼2. 5 88.95 5. 0 103.20 CON-hhONH阁。华人民共和国家标准牛原中玉米赤霉醇、己烯雌酣、己皖雌酣、双烯雌酣残留量的测定液相色谱串联质谱法GB/T 20767-2006 国由t* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0，75 字数14千字2007年3月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2007年3月第一版定价14.00元斗等书号，155066 1-28975 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)6853353320767-2006
