1、ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准G/T 20766-2006 牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤毒醇、玉米赤霉国同、己烯雌盼、己烧雌酣、双烯雌酣残留量的测定液相色i普m串联质谱法Method for determination of zearalanol , zearalanone, diethylstilbestrol , hexestrol and dienoestrol multi-residues in bovine and equine liver, kidney and muscle一LC-MS-MS method 2006国12-31发布2007回03-01实施中华
2、人民共和国国家质量监督检验检度总局也世中国国家标准化管理委员会战叩GBjT 20766-2006 前牛一一同本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位:中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人:庞国芳、许r5、林安清、古珑、何佳、张曼。本标准系首次发布的国家标准。I 1 范围牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤毒国同、己烯雌盼、己烧雌盼、双烯雌盼残留量的测定液相色谱m串联质谱法GB/T 20766一-2006本标准规定了牛猪肝肾和量液
3、相色谱-串联质谱测定己烯雌盼、己炕雌酷、双烯雌酣残留本标准适用于牛猪量的测定。本标准的方法的修改单(不GBjT 63 (GBjT 6379. GBjT 63 性与再现性的3 原理试样中残留的冲溶液加酶解剂分4 试剂和材料的最新版测量方除另有说明外，所用试剂均为4. 1 叔丁基甲基醒:色谱纯。4.2 乙酸:优级纯o4.3 乙酸铀CCH3COONa.3日20)。一级水n醋、己烧雌酣、双烯雌酣残留皖雌酣为o.5gjkg， 文件，其随后所有成协议的各方研究准。分:总则与定义准扭量方法重复丁基甲基酷和乙酸盐缓测定，保留时间和离子4.4 乙酸盐缓冲榕液:0.2 mol/L , pH= 5.20称取2.72
4、 g乙酸(4.2)和12.95g Z.酸制(4.3)溶解于800 mL 7.k中，用氢氧化铀溶液(4.6)调节pH值至5.2士O.1，加水定容至1000 mLo 4.5 氢氧化铀:优级纯。4.6 氧氧化铀洛液:3mol/L。称取120g氢氧化铀(4.5)梅于1000 mL去离子水中。4. 7 甲醇:色谱纯。1 GB/T 20766-2006 4.8 乙睛:色谱纯。4.9 乙酸乙醋1色语纯。4.10 正己皖:色i普纯。4. 11 二氧甲烧:色谱纯。4.12 梅解液=正己烧+二氧甲蜿(60十40)。量取60mL正己;院(4.10)与40mL二氧甲:境(4.11) 泪舍。4. 13 淋洗踉:乙酸乙酣
5、+正己;民(6+94)。量取6mL乙酸乙酣(4.9)与94mL正己皖渴合。4. 14 洗脱液z乙酸乙醋+正己烧(60十40)。量取60mL乙酸乙醋与40mL正己皖提合。4. 15 日-葡糖昔酸酶:H-2型，含萨葡糖昔酸酶124400units/mL，硫酸醋酶3610 units/mL。4. 16 激素及代谢物标准物质z玉米赤霉醇(包括r玉米赤霉醇和自-玉米赤毒醇，各50%)，纯度二97%;玉米赤毒酣，纯度二三97%;己烯雌酣，纯度注99%;己:境雌酣，纯度二三98%;双烯雌酣，纯度二三98%。4. 17 激素及代谢物标准溶液:分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酣、己烯雌酣、双烯雌酣和己:届
6、雌酣标准物质，用甲醇(4.7)配制成1.0 mg/mL标准储备溶鞭。再根据需要以甲晖配制成不同坡度的报合标准榕液作为标准工作需液，保存于4.C冰箱中，可使用三个月。4. 18 内标标准物质:J武代玉米赤毒醇(包括阶玉米赤霉醇-4j瓦代和-玉米赤霉醇-4j在代，各50%)，纯度;?:99%;己烯雌酣-8j瓦代，纯度二三98%.4. 19 内标标准榕搜z准确称取适量玉米赤霉酶-4J在代和己:精雕酣-8j瓦代标准物质，用甲醇分别配制成1.0 mg/mL内标标准储备搭霞。再以甲醇稀释成与5ng/mL玉米赤酶醇和己情雌酣峰面积或峰高相当被度的棍合内标标准工作梅攘，保存于4.C冰箱中，可使用三个月。4.2
7、0 硅股目相萃取柱:500 mg , 3 mL。使用前用6mL正己惋分两次预洗硅肢柱，流速均为4 rnL/min. 4.21 0.45m滤膜。5 仪器5. 1 液相色谱-串联质谱联用仪:配有大气压化学电离摞。5.2 分析天平:感量。.1mg和0.01g. 5.3 自动固相萃取仪或国相萃取装置。5.4 高速均质器:转速大于10000 r/min. 5.5 氮气故缩仪。5.6 涡旋振荡器。5. 7 离心机:转速大于3000 r/mino 5.8 pH汁:测量精度士0.2pH单位。5.9 具塞试管:25mL,50 mL 5. 10 微量注射器.25L，100L.6 试样的制备与保存6. 1 试样的制
8、备取有代表性样品500g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品盒中，带封，并做上标记。6.2 试样保存制备好的试样置于一18.C冰柜保存。2 7 测定步骤7. 1 基质混合标准溶液的制备7. 1. 1 试样的称取GB/T 20766-2006 称取5个阴性样品，每个样品为5g(精确到O.01 g)，置于50mL离心管中，分别加入不同量调合标准工作溶液(4.17) ，使玉米赤霉醇、玉米赤霉国同和己皖雌酣的浓度为1.25 ng/mL、2.5ng/mL、5.0 ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL ;己烯雌酣和双烯雌盼的浓度为2.5 ng/mL、5.0吨/mL、10 ng
9、/mL、25ng/mL、50ng/mLo再分别加入适量内标标准溶液(4.19)，使内标物被度均为10 ng/mL 7. 1. 2 提取加入20mL叔丁基甲基酷(4.1) ，在10000 r/min转速下高速均质(5.4)1 min. 3 000 r/min离心(5. 7) 5 min，将上清被全部转移至另一50mL具塞试管(5.9)中备用。离心管中的残渣置于通风橱中挥发30min，加人15mL乙酸盐缓冲液(4.4) ，高速均质1min, 3 000 r/min离心5min，将上清液全部转移至另一25mL具塞试管(5.的中，并在氯气被缩仪(5.5)上于40.C水恪中吹去残余叔丁基甲基醒后，加入8
10、0L-葡糖昔酸酶(4.15)混匀，于52.C烘箱中放置过夜。在此援冲榕被中加入氢氧化制溶液(4.6)将播液pH值调至7，加入10mL叔丁基甲基酶，充分?昆合，3000 r/min离心2min.移取叔丁基甲基酷层与前述的叔丁基甲基酿提取液?昆合，在氯气浓缩仪上于40.C7J20-50 土25碰撞气能量/V一35一35-42 一34-22 -46 -40 -40 去簇电压/V一100一100一126-126 -100 一100一90一90-90 一90一75一75一73一74物质和内标物的间偏差在士2.5%谱图中对应的定性应的待测物。%. 主二10士50在仪器最佳工作条件下，基质混口吨问(7.1)
11、分别如刷工作榕液浓度为横坐栋，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用内标法进行定董橱定了样品梅液中玉米赤霉酶、己烯雌酣、己烧雌酣和双烯雌酷撒素的响应值应在工作曲线范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，标准物质液相色谱串联质谱的多反应监测(MRM)色谱图参见图A.10 本方法的添加回收率数据参见附录B。7.5 平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6 空自试磕除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。4 G/T 20766-2006 8 结果计算试样中被测物的测定结果可由数据处理系统按内标法自动计算，也可按式(1)汁算:式中:Ai V 1 000 X Z A7一一一一X.;.-一
12、一o As . Csi Ai m 1 000 X一一试样中被测物残留量，单位为微克每千克(g/kg);. ( 1 ) Cs一一基质标准工作溶被中被测物的浓度，单位为纳克每毫升Cng/mU;A一一试样梅液中被测物的色谱峰面四_耐刷刷翻邵阳呗愉ll1，As-基质标准工作;容被中被测物毡谱峰面积;Ci一试样溶液中内标物的尸单位为Csi一一基质标准工作溶液Asi一一基质标准工作溶A一一试样梅液中内注:玉米赤军主醇和己9 精密度本标准的精密以95%的可信度来9. 1 重复性在重复性试验霉醇、玉米赤军军酬、如果差值超过9.2 再现性在再现性试验霉醇、玉米赤霉酣、己烯化合物名称玉米赤霉醇玉米赤霉酣己烯雌盼双
13、烯雌盼己烧雌盼O. 5010. 0。O. 255. 00 注:1n为两次m定结果的算术平均值。19 r= 0.954 6 19 m-O. 737 9 复性限r程见表30测定。中玉米赤0.815 2 19 m一0.6343 R=1.20641gm.一0.5195 lg R= 1. 084 6 19 m一0.5621 19 R=O.8781 19 m.-O. 247 1 19 R=O. 908 8 19 m一0.4473 5 GB/T 20766-2006 附录A(资料性附录)玉米赤喜醇、玉米赤理酬、己烯雌酣、己烧雌醋、现烯雌酣标准物质及玉米赤葛醇-4先代、己烯雌酣-81在代内标物的多反应监测(M
14、RM)色i普图玉米赤霉醇、玉米赤霉酣、己烯雌醋、己烧雌酣、双烯雌酣标准物质及玉米赤毒醇47页代、己烯雌酣-8)瓦代内标物的多反应监测(MRM)色谱图，见图A.Llt1BBEEP晴au，bFm口UHEII 玉米赤草草醉321. 1/277. 2 J飞飞-._.-甸. 俨I/min a) 玉米赤霉醇2.96 -4Jil-喃的EURb-mEDHE玉米赤得嗣319.3/205.1 L . tlmin b) 玉米赤霉自同tl1i41tat-i au,bzzgE 2.54 :a 玉米赤军事回事-41古代325. 1 / 236. 1 ,.-tlmin c) 玉米赤霉醇-4页代;二-F 一i3ifjT士fJ
15、d) 己烯雌盼444EEEEEEAaru忌EEMRhL 己炕雌盼269.0/134.0I/min e) 己皖雌酣!il-llA aunbzEE Tad-th A-J烯跚265. 0 / ,235. 1 国tlmin 11!iL auEE百【喝=f) 双烯雌盼2.97 l3I己脚时代257.1/245.0牛)_, .人(tlmin g) 己烯雌盼-8瓦代圈A.l玉米赤霉醇、玉米赤霉醋、己烯雌酣、己皖雌酣、双烯雌酣标准物质及玉米赤葛醇-41在代、己烯雌酣-8j在代内标物的多反应监测(MRM)色谱图6 附录B(资料性附录)回收率五种撤素及代谢物添加放度及其平均回收率的试验数据，见表B.LGB/T 2
16、0766-2006 表B.1 五种激素及代谢物添加琅度及其平均回收率的试验数据激素名称添加浓度!(问!kg)平均回收率/(%)0.5 84.93 玉米赤霉醇2.5 88.58 5. 0 91. 35 O. 5 76. 10 玉米赤霉酣2. 5 79. 18 5.0 10 1. 00 1. 0 80.12 己烯雌盼5. 0 78.67 10.0 102. 70 1. 0 74.83 双烯雌盼5.0 93.00 10.0 99.53 0.5 91. 33 己炕雌盼2. 5 72.67 5. 0 92.47 SON-hONVML阁。华人民共和国家标准牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤葛翻、己烯雌酣、己惋雌酣、双烯雌酣残留量的测定施相色i曹-串联质谱法GB/T 20766-2006 国出a4晤中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销当母印张O.75 字数16千字2007年3月第一次印刷开本880X12301/16 2007年3月第一版定价14.00元* 书号:155066 1-28974 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T
