1、ICS 65120B 46 疽亘中华人民共和国国家标准GBT 2 1 035-200720070621发布饲料安全性评价喂养致畸试验Feed safety evaluation-Feeding teratogenicity test2007-09-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局借焘中国国家标准化管理委员会及111前 言GBT 21035-2007本标准是在参阅了GB 15193142003致畸试验及国内外相关文献的基础上，根据我国技术发展水平研究制定的。本标准由农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：中国农业大学动物医学院、中国兽医药
2、品监察所。本标准主要起草人：沈建忠、肖希龙、黄齐颐、张素霞、吴聪明。饲料安全性评价喂养致畸试验GBT 2 1 035-20071范围本标准规定了喂养致畸试验的基本技术要求。本标准适用于饲料和饲料添加剂的致畸性评价。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 149221 实验动物寄生虫学等级及监测GB 149222实验动物
3、微生物学等级及监测GB 149241实验动物 配合饲料通用质量标准GB 149242实验动物配合饲料卫生标准GB 149243实验动物小鼠大鼠配合饲料GB 14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31妊娠率gestation index妊娠鼠数占确认交配雌鼠数的百分比。32分娩率parturition index分娩话仔雌鼠数占妊娠鼠数的百分比。33死胎率fetal mortality死胎仔数占分娩胎仔总数的百分比。34畸胎出现率incidence of terata畸胎总数占活胎仔总数的百分比。35畸胎总数sunl of terata出现畸形的所有活胎仔数。36单
4、项畸形出现率incidence of single teratosis出现某种畸形的活胎仔数占活胎仔总数的百分比。1GBT 21035200737活胎仔平均畸形出现辜mean incidence of teratosis畸形总数占活胎仔总数的百分比。38畸形总数sum of teratosis所有活胎仔出现的各种畸形种类数。39母体畸胎出现率incidence of terata parturition分娩畸胎的母体数占妊娠母体总数的百分比。4试剂殛其配制除特别注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GBT 6682规定的二级用水要求。41 乙醇固定液：95乙醇。42鲍因(Bouin
5、s)固定液：取饱和苦味酸溶液750 mL、40甲醛250 mL和乙酸50 mL混合而成。43氢氧化钾溶液：分别配制1和2两种不同浓度的氢氧化钾溶液。44茜素红(alizarin red)贮备液：将茜素红加入5 mL乙酸、10 mL纯甘油和60 mL 1水合氯醛的混合液中至饱和。45茜素红应用液：取茜素红贮备液1 mL，加1氢氧化钾溶液至1 000 mL，用前临时配制。46脱水透明液A：甘油20 mL、2氢氧化钾溶液3 mL，加蒸馏水至100 mL。47脱水透明液B：甘油50 mL、2氢氧化钾溶液3 mL，加蒸馏水至100 mL。5仪器与设备51实验室常用设备。52放大镜和解剖显微镜。53游标卡
6、尺(百分尺)。6实验动物及饲养管理常用实验动物为大鼠、小鼠。首选大鼠，雌雄比例为1：1或2：1，大鼠交配时约1214周龄，小鼠910周龄。使用清洁级大鼠和小鼠应符合GB 149221和GB 149222的要求。实验动物饲养环境应符合GB 14925的规定，并注明动物饲养室的光照和通风条件，每天记录温度、湿度。笼养大鼠每笼不超过5只。饲料应符合GB 149241、GB 149242和GB 149243的规定。7剂分组至少设4组，即1个空白对照组(或溶剂对照组)和3个试验组。试验组剂量一般选择在1101100母体LD5。之间。高剂量一般应使母体产生中毒症状；低剂量应不引起母鼠产生可观察到的中毒症状
7、；在高剂量组与低剂量组之间设1个2个中莉量组。设1个空白对照组(或溶剂对照组)，必要时，还要设阳性对照组。每组孕鼠不能低于12只。8操作步骤8，1受试物给予与观察一般采用混饲或混饮给予受试物。原则上雄鼠交配前4周8周开始给予受试物直至交配成功，确证雌鼠受孕为止。雌鼠从交配前2周4周开始给予受试物至孕期的第13天第15天。在试验期间，每天观察试验鼠的体征、行为活动、采食和饮水情况。每周至少称1次体重，并同时计算采食量。2GBT 21035-200782受孕检查雌、雄大鼠按1：1(或2：1)同笼后，每日早晨检查笼底有无阴道栓(石蜡状圆柱体)或用浸湿生理盐水的棉签取阴道分泌物涂布于滴有1滴生理盐水的
8、玻片上，置低倍显微镜下检查有无精子。发现阴道栓或精子的当天定为孕期的0 d。一般每组应获得13只15只受孕鼠，以保证实验结束时妊娠母鼠数不少于12只。83孕鼠称重孕鼠于孕期的0 d、7 d、14 d和20 d称重，以观察孕鼠的体重变化，随时注意记录孕鼠的状况。84孕鼠处死和检查大鼠在孕期第20天(小鼠第19天)将孕鼠处死。沿腹中线剖开腹腔，取出子宫。分别检查并记录左、右侧卵巢黄体数、窝重(子宫连胎鼠)、子宫重、着床数、活胎数、死胎数(含早期及晚期死胎)和吸收胎数。85活胎鼠检查逐个记录活胎鼠体重、性别、体长，外观检查头颅外形、面部、躯干、四肢等有无畸形，包括露脑、脑膨出、眼部畸形(小眼、无眼、
9、睁眼等)、鼻孔扩大、单鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢及尾畸形等等。86胎鼠骨标本制作与检查将每窝二分之一的活胎(奇数或偶数)放人乙醇固定液(41)中固定2周3周。取出胎仔(可去皮、去内脏及脂肪)流水冲洗数分钟，放人至少5倍于胎仔体积的12氢氧化钾溶液(43)中作用8 h72 h，然后将胎仔放人茜素红应用液(45)中染色6 h48 h，并轻摇1次d2次d，至头骨染红为宜。再将胎仔放人透明液A(46)中1 d2 d。放入透明液B(47)中2 d3 d，待骨骼红染而软组织基本褪色为止。将胎仔标本放人小平皿内，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，逐步检查骨骼。检查时先测量囱门的大小、矢状缝的宽度、头顶问骨
10、及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目、缺失或融合(胸骨为6个，骨化不完全时首先缺第5胸骨、次缺第2胸骨)，检查肋骨(肋骨通常为12对13对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨断裂)，检查脊柱发育、椎体数目(颈椎7个，胸榷12个13个，腰椎5个6个，骶椎4个，尾椎3个5个)以及椎骨有无融合、纵裂等，最后检查四肢骨。87胎鼠内脏检查将每窝二分之一的胎鼠放人鲍因固定液(42)中，两周后作内脏检查。先用自来水冲去固定液，将鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。观察不同切面器官的大小、形状和相对位置。切面制作见图1。J莎 一l一 )r )- kL 、l置
11、l经口从上腭与舌之间向枕部横切(切面1)，可观察大脑、间脑、正脑、舌及颚裂2从眼眶前绿垂直纵切(切面2)，可观察鼻道，鼻中隔，3从头部经眼球中央垂直缴切(切面3)，可观寨眼球、视网膜、嗅球；4从头部最大横位处纵切(切面4)，可观察大脑及脑室I5沿下囊水平穿过颈部横切(切面5)可观察舌、咽、气管、食管和延髓。图1 胎鼠切面制作示意图GBT 21035-2007以后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检查心、肺、横膈膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位置，查毕将其摘除，再检查肾脏、输尿管、膀胱、子宫和睾丸位置及发育情况。然后将肾脏切开，观察有无肾盂积水与扩大等。9统计处理和结果评价根据检查情况，分别计算各组实验动物的妊娠率、分娩率、死胎率、畸胎出现率、单项畸形出现率、活胎仔平均畸形出现数、母体畸胎出现率等。计算畸胎总数时，1个活胎仔出现1种或1种以上畸形均记为1个畸胎；计算畸形总数时，如1个活胎仔表现出几种畸形，则应将相应数目记人总数。选用r检验或方差分析对试验结果进行分析评价。如试验组的上述指标显著高于对照组，并有剂量一反应关系，可判定受试物具有致畸作用。
