1、ICS 65120B 46 囝目中华人民共和国国家标准GBT 21 1052007动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法PCR方法Identification of Canis derived materials in animaloriginatedfeedstuffs-PCR method2007-1 0-24发布 2008-04-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局磐士中国国家标准化管理委员会及仲刖 吾GBT 21 1052007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共和
2、国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、王岩、于立新、徐宝梁、陈颖、吴亚君、宗卉、温燕辉、曹际娟。本标准首次发布。动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法PCR方法GBT 2”05电0071范围本标准规定了动物源性饲料中狗(Canis)源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为01。本标准适用于动物源性饲料中狗源性成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，
3、然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991 饲料 采样(GBT 1469912005，ISO 6497：2002，IDT)SNT 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31聚合酶链式反应 polymer嬲e chain reaction；PCR用于扩增位于两段已知序列之间DNA(deoxyribonucleosidea acid，脱氧核糖核酸)的方法。模板DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核
4、苷酸片段即引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP(de-oxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸)为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个30个扩增循环，扩增倍数达到约106。4原理利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的NA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。5试剂和材料51525354除另有规定外，试剂为分析纯或生化试
5、剂，实验用水符合GB 6682的要求。狗源性成分检测用引物(对)序列为：canis F：5一-TCCAGGTAAACCCTTCTT一3canis R：5-TACGAGCAALGGGTTGATGG-3TaqDNA聚合酶(Taq，Thermus aquaticu，水生栖热菌)。限制性内切酶：Hph I酶。dNTPs：dATP(deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidlne triphos-】GBT 21 1052007phate，脱氧胸苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸)、dG
6、TP(deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸)。55琼脂糖：电泳纯。56溴化乙锭。57三氯甲烷。58异丙醇。59 70乙醇。510分子量标准品(100 hp2000 bp)(bp：base pair，碱基对)。511裂解液：1CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，005 molL TrisHCI(pH 80)Tris：tris(hydroxymethyl)aminometbane，三(羟甲基)氨基甲烷，07 molL NaCl，001 molL EDTA(pH8o)(ethylene diaminetetraa
7、cetic acid，乙二胺四乙酸)。512 TE缓冲液(TrisHCI、EDTA缓冲液)：10 mmolL Tris HCl(pH80)，1 mmolL EDTA(pH8O)。513 10PCR缓冲液：100mmolLKCI，1 60mmolL(NH4)2sQ，20mmolLMgS04，200mmolLTrisHCl(pH88)，1Triton X-100(t一。ctylphenoxypolyethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇)，1 mgmL BSA(bovine serum albumin，牛血清蛋白)。514电泳缓冲液：riffs 54 g，硼酸275 g，05 molL
8、TE缓冲液(pH8o)20 nlL，加蒸馏水至1 000 mL；使用时10倍稀释。515溴化乙锭贮存液：用水配制成10 mgmL。516加样缓冲液；025溴酚蓝，40(质量浓度)蔗糖水溶液。517酶切缓冲液：10 mmolLIrisHCI(pH75)，10 mmolL IVlgCl2，50 mmolL Nacl，01 mgmL BSA。6仪器设备61 DNA热循环仪。62核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。63恒温水浴锅。64离心机：离心力12 000 g。65微量移液器。66电泳仪。67紫外检测仪。68 pH计。69天平：感量001 g。7试样选取与制备按照GBT 146991采样，将实验室样品
9、粉碎，充分混合均匀后待用。8检验步骤81样品的总DNA提取称取适量饲料(饲料粒度为100目称取50 mg；60目称取100 mg；20目称取200 mg)于15 mL离心管中，加入600 pL800 pL裂解液，6530 rain，期间不时振荡混匀；12 000 g离心5 rain；转移上清于洁净离心管中，加400 pL三氯甲烷+异戊醇(24+1)，混匀；12 000 g离心5rain，取上清液；加08倍体积异丙醇，沉淀；12 000 g离心5min。弃上清液；70乙醇洗涤一次，晾干；加入50 pLTE，溶解沉淀。也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。2GBT 21105200782 DN
10、A浓度和纯度的测定取5 pLDNA溶液加双蒸水稀释至1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值A：。和A：舳。DNA的浓度按式(1)计算：cAN501 000 (1)式中：cDNA浓度，单位为微克每微升(pg肛L)；A260 rim处的吸光值；N核酸稀释倍数。当A：。A。比值在1719之间时，适宜于PCR扩增。83 PCR扩增25 pL的反应体系，在02mL的PCR反应管中，引物canis F和canis R各200 nmolL，10PCR反应缓冲液，2 mmolL MgCl2，200 nmolL dNTPs，15 U Taq DNA聚合酶，10
11、pL DNA模板(100 ng50 ng DNA)。设立阳性对照、阴性对照、空白对照组。PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般的反应程序为：9CC预变性3 min。94|。C变性45 s，56C退火45 s，7212延伸45 s，35个循环。7222延伸5 min。4保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含狗源性成分的样品作阳性对照，用已知不含狗源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。84 PCR扩增产物电泳检测取2 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为05,gmL，制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液
12、NI目rJN没过凝胶。将5 tLL8 tLL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。9 Vcm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。85限制性内切酶酶切及产物电泳检测如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。反应体系(20 pL)：HphI酶2U，酶切缓冲液2 pL，加入PCR扩增产物至总体积20 pL。酶切在37*(2下进行，20 rain。酶切完成后电泳，方法见84。9结果判断与表述91 PCR扩增产物电泳检测结果阳性样品的PCR扩增产物大小为213 bp(序列参考附录A)。92限制性内切酶酶切结果阳性样品PCR产物采用内切酶
13、Hph I酶切后，酶切片段大小为179 bp和34 bp。93结果表述PCR产物和酶切产物都为阳性者判为含有狗源性成分，表述为检出狗源性成分；PCR产物为阴性者判为不含有狗源性成分，表述为未检出狗源性成分。10检测过程中防止交叉污染的措施按照SNT1193执行。11废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。GBT 211052007附录A(资料性附录)PCR产物测序结果TCCAGGTAAA CCX3TTCTTCC CTCCZCTATG TACGTCGTGC戌丌A ATGGTT T00CCCArGCATATAAGCAT GTACATAATA TTATKc&3GhK 1龇KK砜k K殴Ac虹GITCACTGATCT GTCAACAGTA ATCGAATGCA 1玛：rCACTTAG 1CAI：、AAGG GCl、AA：【AC(：戌r()0CIGA GAAAOC艘A ACCCIv玎)xG1=A
