1、ICS 67040X 04 a雪中华人民共$-n国国家标准GBT 22509-2008动植物油脂 苯并(倪)芘的测定反相高效液相色谱法Animal and vegetable fats and oils-Determination of benzo(a)pyreneReverse-phase high performance liquid chromatography method2008-I 1-04发布(ISO 15302：2007，MOD)20090120实施宰瞀徽紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会促1”刖 吾GBT 22509-2008本标准修改采用ISO 15302：2007E
2、动植物油脂苯并(n)芘的测定反相高效液相色谱法(英文版)。本标准与ISO 15302：2007相比主要技术性差异为：删除了名词术语；对仪器设备作了适当修改；增加了氧化铝活度的测定方法；将洗脱试剂石油醚(4060)或正己烷更改为石油醚(3060)或正己烷；将待测液定容体积250 pL更改为i00 pL，将进样体积50 pL更改为10“L；将内标法定量计算更改为外标法定量计算。本标准的附录A、附录B、附录C和附录D均为资料性附录。本标准由国家粮食局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。本标准起草单位：大连市产品质量监督检验所、国家粮食质量监督检验中心、大连标准检测技术研究中心。本标准主要起草
3、人：董广彬、郑顺利、王春燕、李鹏、潘炜、姜俊、李海燕、顾鑫荣、关成、毛希琴、勇艳华、刘志璋、张晓凡。1范围动植物油脂苯并(n)芘的测定反相高效液相色谱法GBT 22509-2008本标准规定了用反相高效液相色谱法测定动植物油脂中苯并(n)芘的原理、试剂和材料、仪器和设备、扦样方法、试样的制备、操作步骤、测试结果的表示及精密度等内容。本标准适用于动植物油脂。本标准方法的最低检出限：01 pgkg。本标准的测量范围：01 pg始50 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然
4、而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1 987，MOD)GBT 15687油脂试样制备(GBT 156871995，eqv IS0 661：1989)3原理样品经溶剂溶解，通过氧化铝柱吸附，用洗脱试剂洗脱苯并(n)芘，用反相高效液相色谱分离，荧光检测器
5、检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。4试剂和材料除特殊要求外，所用试剂为分析纯试剂。当使用推荐试剂以外的分析纯试剂时，应全部进行空白试验并报告空白分析的结果。41水：符合GBT 6682规定的一级水要求。42石油醚(沸程3060)或正己烷：每升加4 g氢氧化钾颗粒重蒸。43乙腈：色谱纯。44四氢呋喃：色谱纯。45乙腈四氢呋喃混合溶液：90mL乙腈(43)和10mL四氢呋喃(44)的混和溶液。46甲苯：色谱纯。47无水硫酸钠。48层析用中性氧化铝(100目200目)：Brockmann活度级(参见附录A)，由活度为I级的中性氧化铝减活制各而成。将90 g经450灼烧12 h的氧化铝放人密
6、闭容器中降至室温，加入10 mL水(41)。剧烈摇动容器15 rain，静置平衡24 h，室温下密闭避光保存。由于不同品牌氧化铝活性存在差异，建议对质控样品进行测试，使氧化铝活性满足苯并(口)芘的回收率要求。建议应做相应的样品回收实验验证氧化铝活性。49苯并(口)芘标准品：CAS编号：50一328，纯度不低于990。1GBT 22509-2008警告苯并(n)芘是一种已知的致癌物质，测定时应特别注意安全防护。测定应在通风柜中进行并戴手套，尽量减少暴露。410苯并(口)芘标准贮备溶液：准确称取125 mg苯并(口)芘(49)于25 mL容量瓶中，用甲苯(46)溶解，定容。此溶液约含苯并(。)芘0
7、5 mgmL，4避光保存，至少6个月内稳定。41 1标准工作液：用苯并(口)芘标准贮备溶液(410)，分别配制苯并(n)芘含量大约为02 pgmL和001 pgmL的两种标准溶液。5仪器和设备51玻璃层析柱(参见附录B)：配有烧结玻璃垫和聚四氟乙烯旋塞。52恒温水浴。53旋转蒸发仪。54高效液相色谱仪：如果使用自动进样器，样品定量环应在序列进样间用乙腈冲洗。55玻璃样品瓶：约1 mL，配有可密封的盖子。6扦样方法实验室接收的样品应具有代表性，且在运输和贮存过程中样品不被破坏或改变。本标准不规定扦样方法，推荐采用GBT 5524规定的扦样方法。7试样的制备按GBT 15687方法制备试样。8操作
8、步骤81样品的净化用玻璃烧杯称取约04 g试样，精确到0001 g，用2 mL石油醚(42)溶解稀释。向层析柱(51)中加入一半高度的石油醚(42)。快速称取22 g氧化铝(48)于小烧杯中，立即转移到层析柱(51)中，轻轻敲打层析柱，使氧化铝均匀沉淀。再装入一层约30 mm高的无水硫酸钠(47)。打开层析柱底部的旋塞，石油醚流出至无水硫酸钠的顶部，关闭旋塞。在层析柱出口端放置一个20 mL的量筒。向层析柱中移入样品溶液，用2 mL石油醚(42)清洗层析柱内壁。向层析柱加入80 mL石油醚(42)洗脱，流速为I mLmin，洗脱液放满20 mL量筒后，弃去。换用圆底烧瓶收集其余洗脱液。将收集的
9、洗脱液在65的水浴中旋转蒸发(53)至05 mL10 mL，转移至一个预先称量的玻璃样品瓶(55)中。玻璃样品瓶置于35的水浴(52)中继续蒸发，并用氮气吹至近干(氮气流量大约为25 mLmin)。用石油醚清洗圆底烧瓶两次，每次1 mL，将清洗液转移至玻璃样品瓶中，继续在35及氮气条件下蒸发至干。称量玻璃样品瓶的质量(精确到01 mg)，计算瓶内残渣质量。旋紧样品瓶盖4储存备用。82测定821推荐的色谱条件推荐的色谱条件如下：a)保护柱：Lichrosorb RP-C18，46 mm75 mm，粒度5 pm；b)色谱柱：多环芳烃分析柱，46 mm250 mm；c)迸样量：10“L；d)流动相：
10、乙腈：水为880：120(体积比)；e)流速：10 mLmin；2GBT 22509-2008f)荧光检测器：发射波长：406 rim(狭缝10 rim)，激发波长：384 rim(狭缝10 nm)。822标准曲线的绘制将标准工作液(411)稀释为五种不同浓度的溶液，每个溶液进样量为10 pL时苯并(n)芘的质量为0004 ng、0008 ng、004 ng、02 ng、04 ng。根据峰的积分面积绘制5点校正曲线，色谱图参见附录C。83样品分析831 向装有待测试样(81)的玻璃样品瓶中注入i00 pL的乙腈四氢呋喃混合溶液(45)。小心涡旋溶解残渣，避免样品瓶盖与溶剂接触。使用标准曲线(8
11、22)，对苯并(n)芘在01 pgkg50 pgkg的范围内定量。苯并(n)芘含量超过10 pgkg的样品可以使用乙腈四氢呋喃混合溶液(45)稀释或减少进样体积。832将10 pL的试样液注入液相色谱仪进行测定。保证注入到色谱柱中试样液溶解的残渣不能超过15 mg，若超过15 mg，需用四氢呋喃(44)稀释或重新进行净化。9测试结果的表示苯并()芘含量按式(1)计算。w：堕迎 c1)m式中：ur 样品中苯并(n)芘含量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的待测液中苯并(n)芘的浓度，单位为纳克每微升(ngPL)；V待测液体积，单位为微升(pL)；m一一样品质量，单位为克(g)。
12、计算结果在0gkglO pgkg之间时保留一位小数，计算结果大于lO pgkg时保留到最接近的整数。10精密度本标准的精密度数据是按照GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的置信区间以95来计算。101重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限r，动植物油脂中苯并(n)芘的含量范围及重复性方程见表1。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。102再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限R，动植物油脂中苯并(n)芘的含量范围及再现性方程见表1。苯并(n)芘添加样品实验室间的测试分析结果见附录D。表1 重复
13、性限和再现性限方程油脂类别 含量范围(pgkg) 重复性限r 再现性限R植物油 0 550 0 r一0084 3仇+0313 R一0i00 m+0256动物油脂 02500 r一0057 7m+0066 4 R一0193 m+oZ17注：m为两次测定结果的算术平均值。GBT 22509-2008附录A(资料性附录)Brockmann氧化铝活度测定方法A1活度定义根据含水量的不同，中性氧化铝可以划分为五种活度等级。Brockmann定义I级氧化铝为450灼烧12 h的氧化铝，、V级氧化铝是I级氧化铝分别加入3、6、10、15的水而制成。A2测定A21层析柱：玻璃层析柱，i5 mmH150 mm，
14、下部垫少许脱脂棉，装入高度为50 rfim氧化铝，敲实。A22试剂：苯+石油醚(1+4)。A23活度测试液的配置：按下列组合方式，分别取每种偶氮染料20 mg，用试剂(A22)定容于50 mL容量瓶中，配置成相应的染料混合溶液。第一对(I)：偶氮苯(azobenzene，AB)和对甲氧基偶氮苯(pmethoxyazobenzene，MAB)；第二对(1I)：MAB和苏丹红I(Sudan I，S I)；第三对()：苏丹红I和苏丹红HI(Sudan III，S 111)；第四对(IF)：苏丹红和对氨基偶氮苯(pamlnoazobenzene，AAB)；第五对(V)：AAB和对羟基偶氮苯(phydr
15、oxyazobenzene，HAB)。A24分别取染料混合溶液I、V各10mL，慢慢加到五支氧化铝层析柱内，待流尽后再加人20 mL试剂(A22)，待流尽后观察有色染料在柱上的迁徙情况，确定氧化铝的活度，如图A1所示。若第一对染料溶液完全吸附在柱上时，该氧化铝活度为I级；若第一对染料溶液的MAB吸附在柱上、但AB流出，而第二对染料溶液的两个组分都吸附在柱上，则该氧化铝活度为级；若第二对染料溶液的MAB组分流出，而第三对染料溶液的两个组分都吸附在柱上，则该氧化铝活度为级；依次类推。曰同 丹同 同 即同目目 目目 目目 目目 V图A1氧化铝活度的确定一NU目附录B(资料性附录)玻璃层析柱装置示意图
16、图B1 玻璃层析柱装置示意图GBT 22509-2008单位为厘米GBT 22509-2008附录C(资料性附录)苯并(口)芘标准色谱图图c1 苯并(口)芘标准色谱图GBT 22509-2008附录D(资料性附录)实验室间结果比对本方法经由7家实验室进行实验室间的测试分析，用鸡油和大豆油样品分别进行三个水平的添加回收实验，对得到的结果按照GBT 63792进行精密度数据统计，统计结果见表D1。表D1统计分析结果鸡油样品 大豆油样品样品添加浓度(pgkg)O 05 10o 500 O 05 100 500实验室个数 7 7 7 7 7 7 7 7平均值(pgkg) 0220 0630 8650
17、45770 0440 8840 46100重复性标准差s，(pgkg) 0010 0027 0237 0960 0027 0498 1477重复性变异系数 4 55 429 274 210 614 563 320重复性限值r(pgkg) o028 0076 0 664 2688 0076 1394 1136再现性标准差S一(pgkg) o126 0139 0609 3236 0033 0 498 1 719再现性变异系数 5727 2206 704 707 750 5 63 3 73再现性限值R(pgkg) 0353 0389 1705 9061 0092 1394 4813GBT 22509-2008参考文献1GBT 5524动植物油脂扦样(GBT 5524 2008，ISO 5555：2001，IDT)
