1、ICS 65.020.30 B 40 道雪中华人民主t-、和国国家标准GB/T 24862-2010 畜禽体细胞库检测技术规程Technical regulation of farm animals somatic cell bank detection 2010-06-30发布2011-01-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布剧昌本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会CSACjTC274)归口。本标准起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:马月辉、关伟军、李向臣、于
2、太永、李晗、何晓红、刘涛。G/T 24862-2010 I GB/T 24862-2010 畜禽体细胞库检测技术规程1 范围本标准规定了畜禽体细胞库检测方法。本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽体外培养细胞鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义3. 1 3.2 下列术语和定义适用于本标
3、准。细胞活率cell motility rate 活细胞占总细胞的百分比。细胞生长曲线cell growth curve 在一代细胞生存期内，依据潜伏期、指数增长期、停滞期和衰亡期细胞动态变化的数值，以细胞培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标而绘制的细胞生长规律曲线。3.3 核型karyotype 体细胞分裂中期整套染色体按照其数目、长度、着丝点位置、随体、主缝痕和次锺痕等相对恒定特征排列起来的图像。3.4 同工酶isozyme 功能相同结构各异的一类催化酶。3.5 汇合度confluency 细胞占其培养表面的比例。4 工作区条件工作区一般要由准备室、缓冲间、元菌室、细胞保存室组成。其中，缓冲
4、间面积应不小于3m2，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度不少于1.5 W/m3 0紫外线灯管距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min30 mino元菌室元菌等级的最低标准应达到万级。5 主要仪器、设备电泳仪及电泳槽、超净工作台、冰箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽消毒器、液氮生物容器、离心机、电子天平、恒温培养箱、CO2培养箱、超纯水装置、凝胶自动成像分析系统和显微镜等。1 G/T 24862-2010 6 清洗与消毒6. 1 玻璃器皿清洗与消毒6. 1. 1 浸泡所需的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡12h。6.1.2 刷洗选软毛毛刷，反复洗刷后用清水冲洗3次，三蒸水冲洗3次后，60.C下烘干
5、后备用。6.1.3 酸浸酸浸时间为24h。6.1.4 冲洗酸漫后先用自来水反复冲洗10次以上，最后用重蒸水浸洗3次5次，烘干包装。6. 1.5 消毒高压灭菌应以0.14MPa-O. 16 MPa的压力下持续15min30 mn。6. 1. 6 初次玻璃器皿使用初次使用玻璃器皿需要先经过浸泡和洗刷再置于5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上，其余操作同6. l. 3、6.l. 4和6.1.5等步骤。6.2 金属器皿清洗与消毒金属材质的器具除了没有酸漫处理步骤外，其余步骤同6.106.3 塑料与橡胶制晶清洗与消毒塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗，之后还需要用2%的NaOH溶液浸泡12 h
6、，清水冲洗和烘干后用1%稀盐酸漫泡30min，再用清水和三蒸水分别冲洗3次，高压灭菌和烘干后备用。高压灭菌以0.073MPa的压力下持续10min。7 主要试剂与溶擅配制主要试剂与溶液配制参见附录A。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682一级用水的要求8 体外培养细胞鉴定8. 1 细胞形态检测8. 1. 1 光学显微镜检测在倒置相差显微镜下，直接观察和记录培养细胞的形态和生长状况。月4贴壁细胞边界清晰，核呈圆形，核浆比率小，细胞排列整齐，无重叠生长。8. 1. 2 Giemsa染色检测将盖玻片置于细胞培养瓶中，在5%C02培养箱中37c培养，细胞形成单层后，取出盖
7、玻片，用磷酸缓冲盐溶液Cphosphatebuffered saline, PBS)冲洗，放在载玻片上，自然干燥。固定液固定10min, Giemsa染色2min，置于显微镜下观察。正常细胞的细胞核被染成紫红色或蓝紫色，细胞质被染成浅红色。8.2 微生物栓测8.2.1 细菌和真菌检测取5L细胞悬液，置于8mL元抗生素培养基中，混匀，300g离心5min，重复2次。再用2mL元抗生素培养基重悬，取0.5mL接种到膜蛋白陈培养基中，置于37.C培养箱以检测细菌;取0.5mL接种到麦芽汁培养基中，置于26.C培养箱以检测真菌。分别培养2周后，晃动悬液，置于显微镜下观察，元异物则细胞未受细菌和真菌污染
8、。2 GB/T 24862-2010 8.2.2 支原体检测将畜禽细胞接种到无抗生素的培养基中进行细胞单层培养，待盖玻片细胞汇合度达到50%60%取出。PBS漂洗，固定液浸泡盖玻片，固定10min后再用PBS漂洗。将Hoechst33258染液滴加到已固定的细胞上，染色30mino用PBS漂洗3次，每次3min5 mino将1滴含1%封片液的PBS滴加到己染色的细胞上，翻转盖玻片盖于载玻片上。用100倍400倍荧光显微镜观察。细胞核外元蓝色荧光小点或丝状荧光物表明细胞未受支原体污染。8.2.3 病毒检测利用酶联免疫吸附试验、免疫酶试验、免疫荧光试验、血凝试验、血凝抑制试验、免疫酶组织化学、放射
9、免疫测定等方法对畜禽体细胞库进行病毒检测。8.3 细胞活率检测细胞汇合度达到80%85%，常规法消化，制成1.0X10个/mL3，0 X 106个/mL的细胞悬液。取一滴悬液和一滴0.4%台盼蓝溶液氓匀，静置2mino用血球计数板计算细胞总数和未着色细胞数。8.4 细胞生长周期鉴定细胞汇合度达到80%-85%，常规法消化，制成悬液，计数。分别向培养板21个孔接种1.0 X 104个2.0X104个细胞，置于37oC、5%COz培养箱中培养。每隔24h计数3个孔内的细胞密度，用血球计数板计算细胞总数，取3孔的平均值，连续计数7do以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。正常生长
10、曲线包括潜伏期、指数增长期、停滞期和衰亡期四个阶段。8.5 细胞表面抗原检测细胞接种在盖玻片上。用固定液固定，一20oC放置20min。弃去固定液，用PBS漂洗3次，每次3 min，加入血清，静置20min，用PBS洗去血清。加入相应的抗，37oC孵育30min，室温放置1h3 ho用PBS漂洗后，加入相应的二抗，37oC孵育20minc用PBS漂洗，封片，镜检。细胞表面特异性抗原与特异性抗体结合，荧光显微镜下进行观察。8.6 细胞核型检测8, 6. 1 秋水仙素处理取对数生长期的细胞，加秋水仙素使其终浓度为0.1g/mLO.4g/mL。在37oC、5%CO2培养箱中继续培养1h6 h，使大部
11、分细胞处于分裂中期。8.6.2 分裂相细胞采集用常规方法消化收集细胞。转入15mL离心管，以300g离心8min，收集细胞。8.6.3低渗弃上清液，加入预热至37.C、0.075mol/L(或0.4%)KCl洛液2mL，轻轻吹打，继续加至10mL, 37 oC温箱中温育30min40 min。8.6.4 预固定在温育后的悬液中加入新鲜固定被1mL，混匀，将悬液以300g离心8min，弃上清。8.6.5 固定加入新鲜固定液5mL，打匀，室温静置20mino 300g离心8min，弃上清。8.6.6 重固定重复8.6. 5步骤，离心后留1mL1. 5 mL上清液，氓匀。8.6.7 滴片取2滴3滴细
12、胞悬液，滴在倾斜45。的预冷载玻片上，干燥。8.6.8 染色用PBS(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色10min，自来水冲洗，干燥。8.6.9 封片将载玻片二甲苯固定两次后，用中性树胶封片。3 GB/T 24862-2010 8.6.10 数据分析统计100个分裂相以确定染色体数目。测量并计算染色体的相对长度、臂比值和着丝点指数，并确定染色体着丝点类型。8. 7 细胞同工酶检测8.7. 1 样晶制备常规方法消化收集细胞，用PBS重悬，记数。用温育PBS洗细胞3次，离心，弃上清液。用蛋白提取液重新悬浮细胞，密度达5.0X107个/mL。将细胞悬液移到1.5 mL离心管中，4.C下以30
13、0g离心2 min，吸取上悬液，以每管20L分装后置一70.C贮存备用。8.7.2 制板和点样灌注分离胶，待分离胶聚合好再加满浓缩肢，插上梳子。向上下槽缓缓加入稀释10倍的电极缓冲液至适量，用微量加液器向每个样品槽加入1昆有1L2L澳酣蓝样品液20L50L.等量上样，放入4.C冰箱。8.7.3 电泳120 V电泳，待澳酣蓝进入分离胶后调电压至220V澳酣蓝迁移至下端、O.5 cml cm处停止电泳。8.7.4 染色切去浓缩肢，用蒸馆水漂洗分离胶两次后，置37.C温箱中避光保温染色2h，拍照。4 GB/T 24862-2010 附录A(资料性附录)主要试剂及溶液配制A.1水实验用水符合GB/T6
14、682一级用水的要求。A.2 平衡盐溶液生理盐水或PBS适用于细胞的漂洗。A.3 PBS 称取4.00g NaCl、0.10g KCl、1.45 g Naz HP04 12Hz 0、O.10 g KHzP04，加超纯水定容至500 mL，调节pH至7.2，高压灭菌，密封后置于4oc条件下贮存。A.4 生理盐水称取4.50g NaCl，加入500mL超纯水，高压灭菌，密封后置于4oc条件下贮存。A.5 培养基85%90%的高糖最低限量必需培养基Cminimumessential medium, MEM)适用于家禽细胞的培养;85%90%的高糖Dulbecco改良Eagle培养基Cdulbecco
15、smodified eagle medium，DMEM)适用于家畜细胞的培养。用于过滤培养基的滤膜直径为0.22m和0.45m。A.6 血清10%15%的胎牛血清Cfetalbovine serum, FBS)适合于家畜和家禽细胞的培养。A.7 消化液称取0.10g或0.25g膜蛋白酶干粉，榕于PBS中，调pH至7.27.4，定容至100mL元菌操作台内，0.22m滤膜过滤除菌、分装，密封后置于一20oc条件下贮存。A.8 冻存MEM或DMEM的基础培养基加入终浓度为10%二甲基亚枫Cdimethylsulfoxide , DMSO)和20%50% FBS, O. 22m滤膜过滤除菌，密封后置
16、于一200C条件下贮存。A.9 膜蛋白膜培养基称取3.00g大豆膜蛋白脏，溶于100mL超纯水中，调pH至7.3，高压灭菌15min20 mino A.10 麦芽汁培养基称取2.00g麦芽汁，溶于100mL超纯水中，调pH至34，高压灭菌15min20 min。A. 11 Hoechst 33258工作液称取5.00mg Hoechst 33258，和10.00mg硫柳隶，溶于100mL PBS，置于棕色瓶中，搅拌30min GB/T 24862-2010 至完全溶解，分装到1.5 rnL的小管中制成Hoechst33258贮存液，一20.C下避光保存。将1rnL的贮存液加到100rnL的PB
17、S中，搅拌45rnin，使终浓度达到5.00g/rnL，4 .C条件下避光保存。A. 12 封片液将22.2 rnL O. 1 rnol/L拧棱酸与27.8mL O. 2 rnol/L Naz HP04加入到50rnL甘油中，调pH至5.5，4.C下保存备用。A.13 固定渣冰乙酸与无水甲醇以1: 3的比例混合，现用现配。A.14 0.4%台盼蓝溶液称取0.40g台盼蓝，加少量PBS研磨粉碎后，再加PBS至100rnL。A. 15 秋水仙素溶液称取10rng秋水仙素，溶于10rnL超纯水配成贮存液，取1rnL秋水仙素贮存液与9rnL超纯水混合。A.16 Giemsa工作液称取1.50 g Gi
18、ernsa干粉，量取50rnL甘油，在研钵内先用少量甘油与Giernsa研磨至元颗粒，再将剩余甘油1昆在一起，56.C加热2h后，加入50mL甲醇搅拌均匀，制成Giernsa贮存液，保存于棕色瓶中备用。1mL贮存液与9rnL PBS混合，制成Giernsa工作液，现用现配。A.17 蛋白提取液将TritonX-100与O.9 % NaCI-O. 06 rnmol/L乙二股四乙酸二铀(ethylenediamine tetra acetic acid，EDTA)溶液按1: 15的比例混匀，4.C下贮存。A.18 肢工作液A液:称取28.80g丙烯酷腊、8.00g甲叉双丙烯酷肢，用100rnL超纯
19、水溶解;B液:称取7.30g三起甲基甲;皖、48mL 1. mol/L HCl、0.4rnL四甲基乙二股定容至100rnL , pH调至8.9;C液:称取38.00g丙烯眈胶、2.00g甲叉双丙烯眈胶、20rnL甘油，定容至100rnL; D液:13 rnL 1 rnol/L HCl, 1. 50 g三是甲基甲烧，定容至100rnL，pH调至6.7;E液:称取30.00g丙烯酷胶、0.80g甲叉双丙烯酷肢，定容至100rnL; F液:四甲基乙二股。A. 18. 1 家畜聚丙烯酷肢凝股配方分离肢用13.35mL超纯水，7.5 mL 1. 5 mol/L三是甲基甲烧，6rnL 40%丙烯酷肢，3r
20、nL 2%甲叉双丙烯酷腊，150L10%过硫酸股，30LF液;浓缩胶用6.5mL超纯水，1rnL C液，2.5rnL D攘，65L10%过硫酸肢，25LF液。家畜乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶所用凝胶配方相同。A.18.2 家禽聚丙烯酷肢凝胶配方A.18.2.1 苹果酸脱氢酶分离胶:9.375mL超纯水，5.625mL E液，9.375rnL 1rnol/L Tris-Cl(pH 8.8) , 0.625 rnL 1%过硫酸股，43.35LF液;6 GB/T 24862-2010 浓缩胶:6.4mL超纯水，1.3mLE液，1.3 mL 1mol/L Tris-Cl (pH 6.的，1mL 1%过硫酸
21、股，10LF液。A. 18.2.2 乳酸脱氢酶分离胶:5.69mL超纯水，5.11mL A液，2.84mL B液，11.36 mL 0.1%过硫酸胶;浓缩胶:6.5mL超纯水，1mL C液，2.5mL D液，65L10%过硫酸肢，25LF液。A.19 电泳指示剂的配制称取1.0 mg澳酣蓝，用10mL蒸馆水溶解后，定容至100mL。A.20 乳酸脱氢酶染色液A液:称取100.00mg乳酸钙，溶于20mL 0.05 mol/L Tris-Cl(pH 8.0)中;B液:称取5.00mg哇哇蓝(thiazolylblue，MTT)，溶于1.0 mL超纯水中;C液:称取2.50mg吩嗦硫酸饵醋(phe
22、nazinemethosulfate，PMS)，溶于1.0 mL超纯水中;D液:称取10.00mg烟酷股腺瞟岭二核昔酸(nicotinamideadenine dinucleotide , NAD)。染色前，将A液、B液、C液和D液混合后，倒入20mL 2%琼脂溶液中，混匀。A.21 草果酸脱氢酶染色玻A液:称取350.00 mg DL-苹果酸，溶于25mL O. 1 mol/L Tris-Cl(pH8. 0)中;B液:称取15.00mg MTT，溶于1.5 mL超纯水中;C液:称取5.00mg PMS，溶于1.0 mL超纯水中;D液:称取10.00mg NADo 将A液、B液、C液和D液?昆
23、合后，倒入25mL 2%琼脂溶液中，混匀。CFON|NC叮NH阁。华人民共和国家标准畜禽体细胞库检测技术规程GB/T 24862 2010 国中母中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数15千字2010年7月第一次印刷开本880X12301/16 2010年7月第一版祷定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-40181 GB/T 24862-2010 打印H期:2010年8月25日F002
