1、ICS 67.200. 10 X 14 GB 中华人民iI工./、春日国国家标准GB/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997 动植物油脂甘三醋分子2-位脂肪酸组分的测定Animal and vegetable fats and oils一Determination of the composition of faUy acids in the 2-position of the triglyceride molecules (ISO 6800: 1997 ,IDT) 2010-06-30发布2011-01-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管
2、理委员会发布GB/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997 前言本标准等同采用国际标准ISO6800: 1997(动植物油脂甘三醋分子2-位脂肪酸组分的测定(英文版)。本标准的内容和结构与ISO6800 :1997一致，作了如下编辑性修改:一本国际标准一词改为本标准气一千一用小数点代替作为小数点的逗号，;一一删除国际标准的前言;在规范性引用文件中，用GB/T5530(动植物油脂酸值和酸度测定代替ISO660: 1996 Animal and vegetable fats and oils-Determination of acid value and of acidity;用G
3、B/T6682 分析实验室用水规格和试验方法代替ISO3696: 1987 Water for analytical laboratory use-Specification and test methods;用GB/T15687 (动植物油脂试样的制备代替ISO 661: 1989 Animal and vegetable fats and oils-Preparation of test sample;用GB/T 17376(动植物油脂脂肪酸甲醋制备代替ISO5509: 1978 Animal and vegetable fats and oils-Preparation of methy
4、l esters of fatty acids;用GB/T17377(动植物油脂脂肪酸甲醋的气相色谱分析代替ISO5508: 1990 Animal and vegetable fats and oils-Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids 。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家粮食局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。本标准起草单位:国家粮食局科学研究院。本标准主要起草人:亵霞、王瑛瑶、张恋、薛雅琳。I GB/T 24894-2010/1806800: 1997 动植物油
5、脂甘三醋分子2-位脂肪酸组分的测定1 范围本标准规定了动植物油脂中甘三醋分子2-位脂肪酸(卢或内位)组分的测定。由于膜脂酶的活性，本方法只适用于熔点45.C以下的油脂。本方法不适用于含有下列组分的油脂:含有十二或更少碳原子的脂肪酸(如:椰子油、棕榈仁油、黄油); 一一含有二十碳或更多碳原子的高度不饱和脂肪酸(多于四个双键)(如:鱼油和海生动物油); 一-含有氧化次基团的脂肪酸。注:双健位置在n-6至n-ll的脂肪酸(如:岩芹酸)被膜脂酶酶解速度非常慢，可能引起错误结果。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内
6、容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 5530 动植物油脂酸值和酸度测定(GB/T5530一2005，ISO660:1996 ,IDT) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008 , ISO 3696: 1987 , MOD) GB/T 15687动植物油脂试样的制备(GB/T15687-2008, ISO 661: 2003 , IDT) GB/T 17376 动植物油脂脂肪酸甲醋制备(GBjT17376-2008, ISO 5509:20
7、00 ,IDT) GBjT 17377动植物油脂脂肪酸甲醋的气相色谱分析(GBjT17377-2008 , ISO 5508:1990 , IDT) 3 原理试样中游离脂肪酸中和后，经柱层析净化，用酶将甘三醋水解成2-单甘醋，经薄层层析(TLC)分离，用气相色谱测定脂肪酸组分含量。4 试剂所有试剂均为分析级，水为符合GBjT6682要求的二级水。4. 1 用于试样净化的试剂4. 1. 1 2-丙醇或乙醇:95%(体积分数)。4. 1. 2 正己烧或石油醒:沸程范围30.C 60 .C。4. 1. 3 2-丙醇:50%(体积分数)或乙醇:50%(体积分数)。4. 1. 4 氢氧化纳溶液:0.5m
8、ol/L. 4. 1. 5 酷溶液:1g酣肤溶于100mL95%(体积分数)乙醇中。4.1.6 活化的中性氧化铝1用于柱层析。最近在260.C温度活化2h的中性氧化铝，达到活性I级，保存在干燥器中。4. 1. 7 氮气。4.2 用于甘三醋水解的试剂4.2. 1 乙醋:不含过氧化物。1 GB/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997 4.2.2 盐酸:6 mol/Lo 4.2.3 胆酸铀溶液:1g/L。4.2.4 钙溶液:220 g/L(生化试剂)。4.2.5 缓冲溶液:1 mol/L三是甲基氨基甲:皖(别名:三是甲基甲胶、2-氨基-2-丙基-1，3-二醇)溶液。用盐酸(4.2.
9、2)调节至pH8(用pH计测量)。榕液在OOC40C条件下贮存，保存期14天。4.2.6 膜脂酶:活性8单位/mg20单位/mg。储存在干燥的冰箱里。使用前取出所需粉状品，使其温度达到室温。注:可使用有良好活性的市售脂肪酶，也可按附录A步骤制备脂肪酶，并检测脂肪酶活性。4.3 用于分离2-单甘醋的试剂4.3.1 乙醇:95%(体积分数)。4.3.2 正己烧或石油醒:沸程范围30oC60 oC。4.3.3 丙隅。4.3.4 硅胶:含有粘合剂，用于薄层层析。4.3.5 展开剂:正己烧或石油酷+乙醒+98%甲酸=70十30十104.3.6 显示剂:2 ，7仁二氯荧光黄乙醇溶液(2, 7哼Dichlo
10、rofluorescein):2 g/Lo 100 mL溶液加1滴1 mol/L氢氧化铀溶液使呈微碱性。4.4 用于气相色谱分析2-单甘醋的试剂参见GB/T17376和GB/T17377。5 仪器实验室常用仪器设备，特别是下列仪器设备:5. 1 用于净化样晶的仪器5. 1. 1 水浴锅:在30t40 oC之间能恒温控制。5. 1. 2 层析柱:用于层析分离，内径13mm、长400mm的玻璃管，配有烧结玻璃过滤板和活塞开关。5. 1. 3 旋转蒸发器:配有250mL圆底烧瓶。5.1.4 氮吹仪:提供氮气流。5.1.5 分液漏斗:500mL。5.1.6 圆底烧瓶:100mLo 5.2 用于甘三醋水
11、解的仪器5.2. 1 离心机。5.2.2 玻璃离心管:10mL，带有磨口暖璃塞。5.2.3 电动振荡器:能使离心管激烈摇动。5.2.4 水浴锅:可恒温控制，温度保持在40oC:l:0.50C。5.2.5 注射器:1mL，配有细针头。5.2.6 秒表。5.3 用于分离2-单甘醋的仪器5.3. 1 展开槽:用于薄层层析，带有磨砂玻璃盖，适合于200mmX 200 mm玻璃板。5.3.2 涂布器:用于制备薄层层析板。5.3.3 玻璃板:200mmX 200 mm。5.3.4 微量注射器:3L/滴4L/滴。5.3.5 喷雾器:用于薄层层析板喷射显示剂。5.3.6 微型刮铲:用于刮下薄层层析板上单甘醋谱
12、带。5.3.7 烘箱:保持温度103oC土2oC。5.3.8 紫外光灯:检测薄层板上的谱带，披长254nm。5.3.9 圆底烧瓶:25mL，配有磨口接头的1m长空气冷凝器。5.3.10 锥形瓶:250mL，带有磨口玻璃塞。5.3. 11 锥形瓶:50mLo 5.3.12 玻璃过滤器:烧结玻璃的孔隙为16m40m。5.3.13 干燥器:内有有效的干燥剂。5.4 用于气相色谱法分析2-单甘醋的仪器参见GB/T17376和GB/T173770 6 取样GB/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997 十分重要的是实验室收到的样品必须有真实代表性，并在运输和贮存期间不得有损坏和变化。抨样
13、不是本标准规定的内容，推荐采用GB/T5524规定的方法杆样。7 试样制备按GB/T15687规定的步骤制备试样。8 分析步骤注:如果要检查测试结果是否满足重复性要求(见10.2)，可按分析步骤8.1-8.6进行两个单独测定。8.1 试样酸值的测定试样酸值按GB/T5530测定。如果酸值低于3%(质量分数)，可按8.3直接通过氧化铝层析柱净化试样;如果酸值高于3%(质量分数)，先按8.2在有溶剂存在的情况下用氢氧化铀中和，然后按8.3氧化铝层析柱净化试样。8.2 氢氧化铀中和将约10g的油样溶解于100mL正己烧或石油酷(4.1.2)中，转入分液漏斗(5.1.5)。加50mL 2-丙醇或乙醇(
14、4.1.1)，几滴酣歌溶液(4.1.5)，加入中和油样游离脂肪酸所需的氢氧化铀溶液(4.1.4)并超量0.5%。用力振摇1min，加50mL蒸馆水再振摇，然后静置。分层后，弃去下层皂液和中间层(粘液和不溶于水的物质)。逐次用25mL30 mL的2-丙醇或乙醇溶液(4.1.3)清洗中和油脂的正己烧或石油膛，直至酣肤的粉红色消失为止。将溶液转移到旋转蒸发器(5.1.3)的底瓶中，在减压条件下去除大部分正己烧或石油醋。减压并通入氮气流(4.1.7)、在30oC40 oC条件下，干燥油脂，直到溶剂完全除去为止。8.3 氧化铝层析柱净化试样15 g已活化的氧化铝(4.1.6)与50mL正己皖或石油酷(4
15、.1.2)制备成悬浮液，边振动边倒入层析柱(5.1.2)中，确保氧化铝均匀沉降。当溶剂液面下降到吸附剂以上1mm2 mm时，把用25mL正己烧或石油酷(4.1.2)溶解的5g油脂溶液，小心地倒入层析柱里，用100mL圆底烧瓶(5.1.6)收集从层析柱流出的洗涤液。减压蒸懵去除大部分榕剂，充入氮气流(4.1.7)，在30.C40 .C温度下干燥油脂，直到溶剂完全除去为止。8.4 水解甘三醋8.4. 1 称取约0.1g净化的试样(8.3)置于10mL离心管(5.2.2)中。如果室温下试样不是液体，将离心管置于60.C 65 .C的水浴锅内，如果试样还不完全液化，继续浸在水浴中，但不超过10s。从水
16、浴锅中取出离心管，迅速进行8.4.2到8.4.5步骤操作。8.4.2 向已液化的试样加入己预先称重的约20mg脂肪酶(4.2.6)和2mL缓冲溶液(4.2.5)。小心摇动，然后加入0.5mL的胆酸纳榕液(4.2.3)和0.2mL氧化钙溶液(4.2.的，盖上塞子小心摇动。这GB/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997 些操作步骤应在30s内完成，立即将管子放入40.C水浴锅内，保持手摇60s土2s。8.4.3 从水浴锅中取出离心管，在40.C下，用振荡器(5.2.3)剧烈摇动120s士2S. 8.4.4 立即加人1mL盐酸(4.2.2)和1mL乙膛(4.2.1)。盖上塞子，并用
17、振荡器(5.2.3)剧烈振摇。8.4.5 离心分离，用注射器(5.2.5)将有机相转移到试管里。如果在环境温度下试样是固态，再用1 mL乙酷浸取，提取物合并到试管中。8.5 分离2-单甘醋8.5.1 薄层艇的制备用乙醇(4.3.1)、正己;皖或石油酷(4.3.2)和丙酣(4.3.3)小心清洗玻璃板(5.3. 3) ，直到脂肪类物质彻底清除。称30g硅胶(4.3.4)装入250mL锥形瓶(5.3.10)中，加入60mL水。盖上塞子，激烈摇动1 min，立即将浆液倒入涂布器(5.3.2)上，在干净的瑾板上涂上0.25mm厚的薄层。接着在空气中至少晾干1h。无论是按上述方法制备的薄层板，还是购买的薄
18、层板，都需要在103.C烘箱中(5.3.7)烘1 h，进行活化。使用前允许薄层板在干燥器(5.3.13)中冷却到室温。为避免酷基转移，硅胶板可用珊酸饱和处理。反应混合物应尽快进行薄板层析分离。由于一些硅胶含有可能影响脂肪酸分析的有机物，建议进行空白测试，确保没有这些物质存在。另外，事先把制备的薄层板放在展开槽中，用溶剂展开到南层板的顶端加以清洗。8.5.2 2-单甘醋的分离用微量注射器(5.3.4)将试样提取液(8.4.5)滴在距薄层板(8.5.1)底边15mm的位置，使细滴组成连续带。将薄层板放人展开槽(5.3.1)，展开槽事先加有展开剂(4.3.5)，并已达到饱和状态。盖上盖子进行层析(层
19、析温度约20.C)，直到溶剂到达薄层板上沿10mm处为止。在约20.C温度的空气中干燥薄层板，用喷雾器(5.3.5)将显示剂(4.3.6)喷涂在薄层板上。在紫外光灯(5.3.8)下标出单甘醋的谱带(Rf值约0.03日，用微型刮铲(5.3.6)刮下，要避免刮到起点线上的物质。在室温下是液体的净化试样(8.3)，收集的硅胶移人烧瓶(5.3.9)，按8.6步骤进行操作。在室温下是固体的净化试样(8.3) ，收集到的硅胶移入50mL锥形瓶(5.3.11)，加15mL乙酷(4.2.1)，充分摇动。把所有硅胶移入烧结玻璃过滤器(5.3.12)，每次用15mL乙酷冲洗过滤器，共三次。收集过滤液用旋转蒸发器除
20、去乙酷至滤液体积为4mL5 mL，将其转移到已称重的圆底烧瓶(5.3. 9)中，用氯气除去余下的乙膛，称重并计算单甘醋的质量。单甘醋的量应占该试样量的10%30%(质量分数)，否则要重新水解甘三醋(8.3)或检查脂肪酶活度(见附录A)。8.6 气相色谱法分析2-单甘醋收集硅胶所获得的单甘醋(或从硅胶中提取的单甘醋)，按GB/T17376方法制备脂肪酸甲醋，采用三氟化棚常规法或中性油脂法。再按GB/T17377气相色谱法测定脂肪酸甲醋。9 结果表示计算出各种2-单甘醋占总2-单甘醋的比值，以质量分数表示结果保留一位小数。10 精密度10. 1 实验室间测试结果附录B汇总了本标准实验室间测试精密度
21、的情况。这些测试结果得出的数值可能不适用于其他浓度范围和测试对象。10.2 重复性在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，在短时间内两个独立测试结果的绝对差值不应超过:脂肪酸醋含量5%(质量分数)时，绝对差:;0.2%(质量分数); 4 GB/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997 脂肪酸醋含量注5%(质量分数)时，毛细管柱法的绝对差1%(质量分数)，填充柱法的绝对差3%(质量分数)。10.3 再现性在不同的实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，两个独立测试结果的绝对差值不应超过:脂肪酸醋含量5%(质量分数)时，绝对差o.5%(质量分数);
22、 脂肪酸醋含量注5%(质量分数)时，毛细管柱法的绝对差3%(质量分数)，填充柱法的绝对差10%(质量分数)。11 实验报告实验报告应说明:一一采样方法(如知道); 所使用的方法z测试结果;如果进行了重复性检验，提供最后结果a本标准中未指定或自选操作，以及可能影响结果的任何细节。实验报告应包括关于样品的所有信息5 G/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997 附录A(规范性附录)脂肪酶的制备和活性的测定.1 脂肪酶的制备将5kg的鲜猪膜脏冻至ooC，除去周围的固体脂肪和连着的组织，在捣碎机中捣碎，获得糊状物。低温下加入2.5L无水丙酣，搅拌4h6 h，然后离心分离。用同体积的丙酣
23、萃取残留物三次以上，然后用1+1的丙酣和乙酷1昆合液萃取两次，再用乙酷萃取两次。在减压条件下干燥残留物48h，获得稳定的粉状物为止，储存于冰箱中。.2 脂肪酶活性的测定用165mL阿拉伯树胶溶液(100g/L)、15g碎冰和20mL已中和的油脂，在合适的搅拌装置中，混合搅拌10min，制备成乳化油。取10mL乳化油置于50mL烧杯中，依次加入0.3mL胆酸铀(200g/L)榕液和20mL蒸锚水。将烧杯置入37oC土0.5oC的水洛锅中(见注1)。插入pH计的电极和螺旋桨搅拌器，用5mL滴定管一滴一滴地加入0.1mol/L氢氧化铀溶液，直到pH达到8.50加入足够量(见注2)精确体积的0.1%(
24、质量分数)的脂肪酶粉末悬浮水溶液，刚加入时pH计仍显示pH8.3，立即启动秒表，滴人0.1mol/L氢氧化铀溶液，维持pH8.3不变，记下每分钟所使用的碱溶液体积，约10min。以时间为横坐标，以维持恒定pH所需碱溶攘的毫升数为纵坐标，将测定值作图，所得图形应是直线。6 注1:液态油脂，水解温度选定37oC，熔点在450C以下的脂肪，可选定40oC，以便进行测定。注2:脂肪酶悬浮液的用量，应使消耗1r碱液约需4rnin-5 rnino一般需要2rnL-5 mL脂肪酶悬浮液，也就是1 rng-5 rng的粉末。脂肪酶单位规定为37oC和pH8.3条件下，每分钟释放1mol酸的酶量。粉状物酶活性A
25、(以脂肪酶单位每毫克表示)，按式(A.1)计算:式中:.( A. 1 ) v-一从图形中算出的每分钟消耗氢氧化铀溶液的体积数，单位为毫升每分钟(mL/min); m一一用于测试的脂肪酶粉状物的质量，单位毫克(mg)，所使用的脂肪酶活性应在8单位每毫克至20单位每毫克之间;C一-氢氧化铀溶液浓度，单位为毫摩尔每升(mmol/L)(c=100 mmol/L)。B.1 使用填充柱的方法附录B(资料性附录)实验室间测试结果GB/T 24894-20 1 O/ISO 6800: 1997 实验室间测试在荷兰完成，参加实验室8个。对猪油、牛油、40%猪油和60%牛油的混合油样品进行测试，给出剔除离群值后的
26、统计结果(根据IS057252J评价)见表B.1。测试结果用脂肪酸中甲醋的质量分数表示。表B.t 填充柱色谱测试猪油和牛油的统计结果脂肪酸C14 0 CI6 O C16 1 C18 0 C18 1 C18 2 C18 3 A)猪油平均含量(质量分数)4.0 70. 6 3. 0 4. 5 11.3 4.0 0.39 重复性标准偏差(5r)O. 14 1. 41 0.51 0.40 0.32 0.15 0.04 重复性变异系数/%3.5 2.0 17.0 8.8 2.8 3.7 9.8 重复性限(r)0.40 4.00 1. 45 1. 13 0.89 0.41 0.12 再现性标准偏差(SR)
27、0.16 1. 78 0.82 0.40 O. 72 0.81 0.09 再现性变异系数1%4.1 2.5 27.4 8. 9 6.3 20.4 22.6 再现性限(R)0.46 5.05 2. 33 1. 14 2.02 2.28 0.27 B)牛泊平均含量(质量分数7.8 14.2 4.5 9.0 55.0 2.5 0.86 重复性标准偏差(5,.) 0.83 O. 54 0.26 0.33 1. 93 0.37 0.11 重复性变异系数/%10.6 3.8 5.8 3.6 3.5 15.0 12.5 重复性限(r)2.34 1. 51 O. 73 O. 92 5. 45 1. 05 0.
28、30 再现性标准偏差(5R)0.84 0.79 0.26 0.50 2.18 O. 69 0.49 再现性变异系数/%10.7 5.6 5.9 5.5 4.0 27.8 57.4 再现性限(R)2国312.23 0.74 1. 40 6.16 1. 96 1. 39 C)猪油和牛泊的混合泊，40+60平均含量(质量分数)6.2 36.8 3.7 7.2 38.2 3.0 0.74 重复性标准偏差(5r)0.58 0.44 0.28 0.74 1. 02 0.20 0.13 重复性变异系数/%9.4 1. 2 7.5 10.3 2.7 6.7 17.3 重复性限(r)1. 65 1. 26 O.
29、 78 2.11 2. 90 0.57 0.36 再现性标准偏差(5R)0.58 1. 78 0.49 0.79 1. 36 0.48 0.25 再现性变异系数/%9.4 4.8 13.1 10.9 3.6 16.2 33. 7 再现性限(R)1. 65 5.05 l. 38 2.23 3.84 1. 37 O. 71 B.2 使用毛细管柱的方法1993年，实验室间测试用3个橄榄油样品由AOCS/I00C进行，24个实验室参加。表B.2给出甘三醋2位C16，0和C18，0脂肪酸组分含量的统计结果(根据IS057252J评价)。7 GB/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997
30、表B.2毛细管柱色谱测试瞰榄油的统计结果样口口口1 5 8 剔除离群值后实验室数23 23 22 平均含量(质量分数0.86 1. 36 1. 02 重复性标准偏差(5，)0.06 0.07 0.06 重复性变异系数/%6. 70 5.42 5.98 重复性限()0.16 0.21 0.17 再现性标准偏差C5R)0.19 0.26 0.17 再现性变异系数/%21. 91 18.51 17.05 再现性限(R)0.53 0.73 0.49 8 GB/T 24894-201 O/ISO 6800: 1997 参考文献lJ GB/T 5524-2008动植物油脂杆样(GB/T5524-2008
31、,IS0 5555:2001 ,IDT). 2J IS0 5725: 1986 Precision of test methods-Determination of repeatability and reproduc ibility for a standard test method by inter-laboratory tests. 9 hmm 。自OFON|叮叮NH闰。中华人民共和国国家标准动植物油脂甘三醋分子2-位脂肪酸组分的测定GB/T 24894 2010/1S0 6800: 1997 祷中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峰开本880X 1230 1/16 印张1字数18千字2010年8月第一版2010年8月第次印刷晤书号:155066 1-40222 定价18.00元GB/T 24894-2010 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533打印日期:2010年8月25H F002
