1、ICS 65.020.30 B 43 中华人民=H工./、道B和国国家标准GB/T 25165一2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法Protocol of identification of bovine , caprine, ovine and porcine derived materials in gelatin-Real time PCR method 2010-09-26发布2011-05-01实施暂且码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准明肢中牛、草、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法GB/T
2、25165-2010 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争争开本880X 1230 1/16 印张0.5字数7千字2010年11月第一版2010年11月第一次印刷* 书号:155066 1-40627 定价14.元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533目lJI=l 本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院。GB/T 25165-2010 本标准主要起
3、草人:陈颖、吴亚君、袁飞、王晶、徐宝梁、张舒亚、杨海荣、王斌、赵勇胜。I 1 范围明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法本标准规定了明胶中牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测。该方法的检出限为0.1%。2 规范性引用文件GB/T 25165-2010 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的寻|用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分
4、析实验室用水规格和试验方法GB 6783食品添加剂明胶GB/T 14699. 1饲料采样GB/T 27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 实时荧光PCRreal time PCR 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2 Ct值cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。4 原理利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用裂解液破碎细胞，酣、三氯甲烧抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进
5、行内参照基因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率;通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对明胶中牛、羊、猪源性成分的定性分析。5 检测用引物和探针内参照引物探针序列及牛、羊、猪特异性引物探针序列见表101 GB/T 25165-2010 表1检测用引物和探针名称序列目的基因内参照5端引物5 -CCTGAGAAACGGCTACCAT-3 , 内参照3端引物5-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3 真核生物内参照探针5-(FA岛。TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)
6、-3 18SrRNA基因牛5端引物5 -CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3 , 牛3端引物5 -GCCAAA TGTCTGGGTGT AGAT ACC-3 生长激素基因牛探针5-(FA如1)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3羊5端引物5 -ACACAACTTCT ACCACAACCC-3 羊3端引物5-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3 线粒体细胞色羊探针5 -(FAM)-ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3 , 京b基因猪5端引物5 -TTTGTGCATGACTGCGTCAAC-3 猪
7、3端引物5 -CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3 阮蛋白基因猪探针5 - (FAM)-CACCGTCAAGCAGC-(NFQ) (MGB)-3 6 试剂苯酣CTris饱和酣，pH8.0)、三氯甲皖、异戊醇、元水乙醇、异丙醇、70%乙醇。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。7 配制溶液7.1 裂解滥成分包括:2% C质量浓度)CTAB C cetyltrithylammonium bromide，十六皖基三甲基澳化镀), 100 mmol/L Tris C tris hydroxymethyl aminomethane，三起甲基氨基甲:皖)，
8、1. 4 mol/L NaCl , 20 mmol/L EDT ACethylene diaminetetraacetic acid，乙二股四乙酸)，用HCl调至pH8.0。7.2 实时荧光PCR反应混合液12.5L反应体系包括:1 U 2 U C U ni t，酶学单位)的Taq酶、1X PCR buffer、2.5 mmol/L 4.0 mmol/L的Mg2+、0.2U 1 U的UNG酶、0.2mmol/L的dCA，C , G) TPs、O.2 mmol/L O. 4 mmol/L dUTP、400nmol/L ROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。8 仪器设备8. 1 实时荧光
9、PCR仪。8.2 恒温水浴锅。8.3 离心机:离心力不小于3000g。8.4 微量移液器:0.5L10L，10L100L，20L200L，200Ll000L。8.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。8.6 pH计。8. 7 天平:感量0.01g。9 样晶采集按照GB6783对食用明胶采样，按照GB/T14699. 1对饲料明胶采样，将实验样品精碎，充分混合均匀后待用。2 GB/T 25165-2010 10 检验步骤10.1 DNA提取称取样品500mg于50mL离心管中，加入5mL裂解液，室温过夜后置于65.C恒温箱中温育1 h2 h，取出后迅速加入与裂解液等体积的室温酣-三氯甲皖-异戊醇(
10、25:24:1)(注意:如果样品因温度下降凝固而元法获得上清，可将样品再次放入65.C恒温箱中使其重新液化)，颠倒混匀，室温下12 OOOg离心10min，转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲皖-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，室温下12OOOg离心10min，转移上清至另一灭菌的离心管中，加入O.8倍异丙醇或2倍体积的预冷元水乙醇混匀，一20.C放置O.5 hl h，4.C下12000g离心10min15 min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，4.C下12OOOg离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50L双蒸水，溶解沉淀，一20.C保存。也可用等效DNA提取试剂盒提取模板D
11、NA。DNA提取过程中以水代替样品设置提取空白对照，并置于每个提取系列中的最后。10.2 实时荧光PCR扩增反应体系的体积为25L，体系组成见表2。表2实时荧光PCR检测反应体系组成试剂名称贮备液浓度加入PCR反应体系的体积/L反应混合液12.5 5端引物10 Ilmol/L 1 3端引物10mol/L 1 探针10mol/L 1 模板5 双蒸水补足至总体积为25实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为:50.C 2min;95 .C 10 min;95 .C 15 s , 60 .C 1 min 45个循环。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和提取空白对照。用分别含牛、羊、猪成分的样
12、品作阳性对照，用不含牛、羊、猪成分的样品作阴性对照。样品设3个重复，对照设2个重复，以Ct平均值作为最终结果。11 结果判定11. 1 PCR有效性判定空白对照:元FAM荧光信号，相应Ct值40.0。阴性对照:元FAM荧光信号，相应Ct值40.0。阳性对照:有FAM荧光信号，且FAM通道出现明显的扩增曲线，Ct值36.0。否则判定为PCR元效。11. 2 DNA提取有效性判定在同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现明显的扩增曲线，Ct值40.0。否则DNA提取元效，应重新提取DNA，直至Ct值40.0.11. 3 检测结果判定在符
13、合11.1和11.2的情况下，使用牛、羊、猪特异性引物和探针对被检样品进行检测:EON-FmNH旨。GB/T 25165一2010如有FAM荧光检出，且Ct值36.0，则判定样品含有相应的动物掠性成分;如Ct值40.0，则判定为不含相应的动物源性成分;如36.0Ct40. 0，则需重复实验，再次扩增后的Ct值仍40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则判定该样品含有相应的动物源性成分;再次扩增后结果Ct值二三40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则判定该样品不含相应的动物源性成分。检测过程中防止交叉污染的措施12 侵权必究书号:155066 1-40627 * 版权专有按照GB/T27403二2008中附录D的规定执行。14.元定价:GB/T 25165-2010 打印日期:2010年12月3R F002
