1、ICS 65.020.30 B 40 中华人民=lI工/、包写和国国家标准G/T 25168-2010 畜禽cDNA文库构建与保存技术规程Technical regulation of farm animals cDNA library construction and preservation 2010-09-26发布 填轨可串伽J/ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2011-03-01实施发布剧吕本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会CSAC/TC274)归口。本标准起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:马
2、月辉、关伟军、陆涛峰、李向臣、佟春玲、余露露、刘鹏。G/T 25168-2010 I GB/T 25168-2010 畜禽cDNA文库构建与保存技术规程范围本标准规定了畜禽cDNA文库构建方法。本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽cDNA文库构建与保存。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款协凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下
3、列术语和定义适用于本标准。3. 1 cDNA compementary deoxyribonucleic acid 以成熟mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的cDNA链。3.2 cDNA文库cDNA Iibrary 将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总RNA，经过反转录等一系列的生化反应合成双链cDNA群体后，再插入到适当的载体上，经转化寄主菌株构成特定的cDNA克隆群体。3.3 喜核昔酸。Iigonucleotide一类只有20个以下碱基对的短链核昔酸的总称，常用作探针确定DNA或RNA的结构。3.4 噬菌斑plaque 被噬菌体感染的细菌所释放的子代噬菌体，会继续感染
4、周围的细胞，致使在琼脂平板上生长的菌苔中有大量的细胞发生裂解，形成的透明区域。4 试剂及溶渡配制除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。4. 1 焦碳酸二乙醋(diethypyrocarbonate，DEPC)处理水在1000mL去离子水中加入1mL DEPC, 37 .C静置12h，高压灭菌(120.C 30 min)。4. 2 2 mol/L MgS04 称取246.50 g MgS04 H2 0，加400mL双蒸水(doubledistilled H2 0 , ddH2 0)溶解后，定容到500 mL，高压灭菌。4. 3 10 mmol/L Mg
5、S04 量取1mL 2 mol/L MgS04加ddH20定容到200mL，高压灭菌，30min。4.4 1 mol/L Tris-Cl(pH7. 5) 称取121.14 g Tris，碱溶于800mL ddH20中，调pH至7.5，定容到1L，高压灭菌。4.5 SM缓冲液称取5.80g NaCl、2.00g MgS04 .7H20，量取50mL 1 mol/L Tris-Cl(pH7. 5)和5mL 2%(质GB/T 25168-2010 量浓度)明胶，定容到1L，高压灭菌。4.6 5 x一链缓冲灌250 mmol/L Tris(pH8. 3) ,30 mmol/L MgClz ,375 m
6、mol/L KCL 4.7 10XDNA连接酶缓冲液500 mmol/L Tris-C1 (pH7.的，100mmol/L MgC12 , 100 mmol/L二硫苏糖醇(di thiothrei t01 , DTT) ,0.5 mg/mL牛血清白蛋白(bovineserum a1bumin，BSA)。4.8 LB液体培养基取10.00g NaC1、10.00g细菌培养用膜蛋白陈和5.00g细菌培养用酵母提取物加1L ddH20溶解后，高压灭菌。4.9 LB固体培养基取10.00g NaC1、10.00g细菌培养用膜蛋白脏、5.00g细菌培养用酵母提取物和20.00g细菌培养用琼脂加1L dd
7、H20溶解后，高压灭菌。4. 10 LB顶层培养基将0.70g琼脂糖加入100mL LB液体培养基中，高压灭菌。4.11 20%麦芽糖取20.00g麦芽糖溶于100mL ddH20中，过滤除菌。5 主要仪器、设备水浴锅、电泳仪、电泳槽、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、PCR扩增仪、超纯水仪、-80.C低温冰箱、凝肢自动成像分析系统和低温离心机等。6 cDNA文库构建6. 1 样晶采集畜禽机体的组织可作为构建cDNA文库的实验材料。将新鲜离体的组织样品迅速投放到液氮中，或剪切成1mm3大小的组织碎块后放入RNA保存液中。6.2 总RNA提取使用TRlz01法提取畜禽组织的总RNA。在不断填
8、充液氮的研钵中将30mg100 mg的组织样品磨碎，加人1mL Triz01(含有酣、异硫氧酸腻、8-是基哇琳和卢琉基乙醇的单相液)，混匀后移至经DEPC处理水浸泡过的离心管中，静置5min.加入200L三氯甲烧，混匀，静置2min3 min, 4 .C 下，13200g离心15min.移上清至另一离心管中，加入400L异丙醇，混匀后静置10min, 4 .C下，13 200g离心10min。弃上清，用DEPC处理水配制的75%乙醇洗涤沉淀2次，室温静置5min 10 min，晾干后用50L100L的DEPC处理水溶解沉淀后用1%变性琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖0.3 g , DEPC处理水21.6
9、 mL ,10XMops 3 mL，37%甲醒5.4mL，核酸显示剂2L3L)检测RNA质量，于-80.C冰箱中保存。6.3 cDNA合成6.3.1 cDNA第一链合成采用5末端RNA转录子转换机制(switchingmechanism at 5 end of the RNA transcript , SMART)技术合成全长cDNA双链。首先取一PCR管分别加入0.05g1.。同总RNA样品、1.0L 10mol/L经过修饰的01igo(dG)的寡核昔酸和1.0L10 mmol/L经过修饰的01igo(dT)3引物，添加DEPC处理水使总体积达到5.0L，混匀，72.C下放置2min，冰浴2
10、min。然后，分别加入2. 0L5X一链缓冲液、1.0L20 mmol/L DTT、1.0L10 mmol/L脱氧核糖核昔三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP)和1.0L200 U/L PrimerscripTM反转录酶，混匀，42.C下放置1h , 冰浴2min终止反应后进行下一步操作或一20t下短期保存。6.3.2 cDNA第二链的合成取-PCR管分别加入2.0L一链cDNA、80LddH20、10L10 X Ex taq缓冲液、2.0L 2 GB/T 25168-2010 2. 5 mmol/L 50 X dNTP、2.0L10mol/L
11、5引物、2.0L10mol/L经过修饰的Oligo(dT)3引物和2.0L5 U/ f.1. L Ex taq酶，总体积为100L，混匀，95.C预变性25s后，95.C变性25s，68C退火延伸6min，共21个循环。用1.1%琼脂糖对5.0LPCR产物进行电泳检测，双链cDNA的分布范围在O. 1 kb4. 0 kb之间。引物序列为:5引物序列5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-33引物序列5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N_1 N-3 (N=A，G，C或T;N-1=A，G或C)6.4 cDNA的纯化、
12、酶切与分离6.4.1 cDNA的纯化取一PCR管分别加入50L2.0g3.。同双链cDNA、2.0L20g/L蛋白酶K，混匀，45.C 下放置20min.然后加入50LddH20和100L苯酣-三氯甲烧-异戊醇(25: 24 : 1)，71混昆匀，1320Og 离心5min.。移上清至另一离心管中，加入10OL三氯甲皖-异戊自晖享(24:1) ，7混昆匀，1320Og离心5min 移上清至另一离心管中，分别加入1刊OL3 mol/L乙酸铀(句pH4.8盯)、1.3L2却O罔g/年L肝糖元、2剖60L95%乙醇，1320Og离心20m旧in.。弃上清，用100L80%乙醇洗涤沉淀后干燥10min
13、，然后加人79LddH20溶解沉淀。6.4.2 cDNA的酶切取-PCR管分别加入79L双链cDNA、10L10XSI缓冲液、10L20 U/LS卢I内切酶和1.0L 100XBSA，总体积为100L，混匀，50.C下放置2h。加2.0L1%的二甲苯胶指示剂，混匀。6.4.3 cDNA的分离重悬分离柱内容物，自然滴尽柱中溶剂，加入700L柱缓冲液，滴尽。加入100L酶切产物，滴尽。加入100L柱缓冲液，滴尽。加入600L柱缓冲液，用16支离心管分别逐滴收集，每管一滴。每管取3.0L样品，用1.1%琼脂糖凝胶进行片段大小检测。收集300bp以上的cDNA片段于一离心管中，分别加入1/10体积3m
14、ol/L乙酸铀(pH4.8)、1.3L20 mg/mL肝糖元和2.5体积95%乙醇，混匀，一20.C下沉淀12h. 4 .C下，13200g离心20min，弃上清，干燥10min, 7.0L ddH20溶解沉淀，混匀，一20.C保存。6.5 cDNA片段与载体的连接取-PCR管分别加入100ng的cDNA、1.0L500 ng/LTripl Ex2载体、O.5L 10XDNA连接缓冲液、0.5L10 mmol/L三磷酸腺昔(adenosine-tri phos pha te , A TP)、O.5L 400 U/LT4 DNA 连接酶，加ddH20使总体积达到5.0L，混匀，16.C下连接12
15、h. 6.6 cDNA重组体的包装解冻包装蛋白抽提物，取10L，加入4.0L连接产物，混匀，22.C下包装2h后加人500LSM 缓冲液和20L三氯甲烧，混匀。进行未扩增文库滴度测定或4.C保存。7 文库的扩增与保存在含10mmol/L MgS04、终浓度为0.2%麦芽糖的LB液体培养基中培养VCS257菌，使细菌OD600值为2.0，1000g离心10min，然后用10mmol/L MgS04重悬细胞，调OD600值至4.O.分别在20个离心管中加入500L的菌液和足够形成6.OX 104个7.OX104个噬菌斑的稀释包装液，37.C放置15min后加到3mLLB顶层培养基中，混匀，立即倒入
16、LB琼脂平板中，涂匀，37.C放置6h18 h，直至噬菌斑相互接触后，每个平板上再加12mL SM缓冲液，4.C放置12h后，50r/min, 37 .C振荡培养1h.最后将噬菌体溶解物移至50mL离心管中，加入10mL三镇甲烧，混匀，2OOOg离心10min，再将上清液转移到另一离心管，加二甲基亚飘(dimethylsulfoxide，DMSO)至终浓度为7%后分装，一70.C长期保存。OFONlF山NH阁。华人民共和国家标准畜禽cDNA文库构建与保存技术规程GB/T 25168-2010 国中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销印张0.5字数7千字2010年11月第一次印刷* 开本880X 1230 1/16 2010年11月第一版14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价 书号:155066. 1-40630 GB/T 25168-2010 打印日期:2010年12月20日F002
