1、ICS 11. 220 B 41 中华人民共和国农业行业标准NY /T 563-2002 禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术Diagnostic techniques for fowl cholera Cavian pasteurellosis) 2002 - 08 -27发布2002 -12 -01实施中华人民共和国农业部发布505 N Y /T 563- 2002 前禽毡J乱(fowtchokra).又名禽巴氏抨商病(avianpasteurclloss).是由亭，主性巴氏轩闲引起的家畜和!j!f禽的接触传染性疫病。本病呈现急性败血症变化，其发病率和死辛jfl向.对养禽业危害严v有.被i廿界动
2、物P.1.组织、WorldOrganization for Animal Hea!th (英)，Offi付Intt-Tltionaldes Epizootic (法hOlE定为B l;JJ物疫锅，我国列为工类动物疫病。本f，);111 I主显i企断技本方面与()IE(珍断试验和疫苗手册)(2000:1版)ZRLLl l条的规定娃致的。们也有以rX异()IE( r册)2.7.门条对只体操作程序未作详细描述，本标准则根据实践经价规定了只体操作lj序;牛二标准冗:采用凭他推荐ft技术。丰标Ifl(，阵.);jA、附注B为规范性附录。丰标准IJ农业部畜牧兽医局提出。牛L标Ifl由专l咀动物检疫标准化委
3、员会归口。本书J;I!U王申，)it )巾国农业科学院哈尔滨冉医研究所。本你准主费起草人3曲连东、吴东来。 () (-j NY /T 563 -2002 禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术1 范围丰标准规定(禽霍乱的诊断技术要求U中二标准适用于鸡、鸭、我丹等禽m乱的诊断和价1聋。2 规范性引用文件F州文件小的条款通过丰标准的创片jI而成为丰标准的条款比izLi ili朔的引j文件.其随后所有的修改Iyt川、也扫勋民的内容)或修订版均不适用于本标准.然1M.鼓励根据非标准达成协议的各方研究是仔时使川i主冉文件的最新版中。凡是不注H期的11!日文件.其最新版乍迈川jj-本标准。(;Il H日9.2H-
4、1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和l试剂l3 初步诊断帆船典I症状和病变.以及在、日微镜下检查组织、涂片发现的树根染色的轩i埔.H) J_!; 诊断牛;病。1M确诊!但依靠病)成分离鉴定。3. 1 症状3. 1. 1 急性型症状l切l|l且禽群i些禽只突然死亡.随后即11J另外禽只!i_热、快ft、J问j(5、流诞、腹内、羽毛粗乱、呼吸困难.临死ffJI H现发绪。3.1.2 慢性症状J二tFfi咐耐过的或由弱;在闲l株感染的禽只门I坠慢件型病程.JttHli 1 j, 0邱感染.在关17、趾塔、隧勒、胸时粘液囊、眼结膜、肉i，、!喉肺、气囊、中耳、骨髓、脑膜等部位rJf纤维京性化服
5、性渗出、坏死或不同程!盘的纤维It.3. 2 病理变化:211 7凹的病变主要是被动性充由1、出血.肝、脾肿大利JiU士tN.坏死.ij，p捷、腹腔有1心包峨增多。慢性呻lil要是局士i部纤维素化版性渗出、坏死和纤维化)3. 3 病料涂片检菌3. 3. 1 抹片的制备川锻f央悖病变组织肝琪脾.然后以灭菌剪刀剪取小块，夹出1;*号Jt新鲜切旬在载破片1-)j; GfI或涂抹1(;薄!三:若*lfil液用灭菌剪1J剪汗心脏进行蘸取或剪取凝血块、用新鲜切国l在载玻片:-1卡印或涂抹成薄层l、3.3.2 干燥(1然燥。3. 3. 3 固定将t.:燥虫f:J 1卡片.涂抹1ft!向上.以其背面在;四精火
6、焰1米11i且d数次.略作hn热进fj国尘。3. 3. 4 革兰氏染色法恼l注:好的抹片l二滴Jm草酸钱结品紫色液.染色Zmin水洗lJU!在H，.1 c腆溶液于抹片娘染2nlln 1)( iJt 1111川?fli内将于抹片脱色1min-;)(洗.hrr稀释碳酸u红红染、(川，在说吸l.镜桥同卒S07 NY /T 563 2002 的原体为革芝氏阴性球杆菌戎短丰|菌.菌体大小为O.2m O. .1mXO.Gm -_乙川lnl.单个或成对存在，常有英膜。3. 3. 5 其他染色法甲醇固定.按GB4789. 28一1994中2.6或2.1规定进行，瑞持氏或美监染色呈两极浓染的菌体。4 病原分离和
7、鉴定4. 1 痕原分离4. 1. 1 病料的采集4.1. 最急性和急性病例口J采集死亡禽只的肝、脾、心血，慢性病例.般采集局部病灶组织;对不新鲜或已被污染的样品J白骨髓中采取病料。采病料时用烧红的刀片烧烙组织.内1;月灭菌锦拭子或接种环通过烧烙去i自I插入组织或心血内取样。4.2 如果为用禽.1通过鼻孔挤出粘液.或将棉拭于插入鼻裂中取中TR 4. 1. 2 培养基制备5%鸡Illl消甜萄糖淀粉坊、脂、鲜血琼脂培养基.配制)j法见附呆AO 4.1.3 动物接种如果病料h染严重.则可将0.2mL碾碎的病料.经皮F或腹腔内战种家兔、小鼠戎易感鸡，接种动物E24 h-州h内先亡.可以从月1脏、心血中分
8、离到多杀性巴氏杆菌。4. 1. 4 培养将的料接种于5%鸡血清的筒萄糖淀粉琼脂(见第A.1章)、鲜血正在脂埔养尊(见第A.2草)在35l:7(r培养.经18h24h培养后前落直径为1mm-3 mm.雨落平散在、圆形.k由凸起呈奶滴状n4.2 病原鉴定4.2.1 培养特性J.J族性1大气l构.FIlt挝适温度为35( 37 l .经18h24 h培养1月.陆j冉自径为1mm-3 mm，是散在的民i形r.IJ起初奶油状.有英膜陶落稍大。4.2.2 镜检从商落上挑取少量涂片.干燥.同定、染色、镜检IJ3. 3. 23. 3. S. 4. 2. 3 生化鉴定鉴定Jilt如1r , a) 接种于简萄糖、
9、庶糖、果糖、半乳糖和甘露醇发酵管产酸而不产气.接种于鼠李糖、戊醒糖、纤维二一糖、绵子糖、绚糖、赤草草糖、戊五醇、M肌醇、水杨由发酵管小发酵。糖发酵管按(;B 478日28-19911 3.2规定配制。h) t阜种TilifJ陈水情养慕巾，可产生时|味。试验饺6日4789.281 19.1巾3.13规定的为法操作。c) 鲜血液琼脂立不产生:溶血。操作方法按G131789.28-1994中1.6脱走进行。d) 麦康凯琼脂t不生长。麦康凯琼脂按GB4789.28一1994中4.24现定配制。e ) 自tt叶子过氧化氛酶(方法按GB1789.28 -1994中:1.20规定进行人氧化酶(方法按(;B4
10、789.28 1991巾3.18规定进行).但不能产生尿素酶(jiiLti(;ll 4789.28-1994中3. I 5规定近行)、且、F乳糖背酶(方法按(;B4789.28 -199.1中:1.:l闭走进行)。f) 维梢(Vl斗试验为阴性。i式验按(;134789.28 . 1994中3.，1规ii:月1主进付。4.2.4 动物接种试验细菌纯IE养物稀释后.以100个细菌经皮下边腹腔内接种家兔、小鼠或妨!这鸡.接种动物在24h 48 I】内死亡.H ill以从肝脏、心血中分离到J多杀性巴氏杆菌。4.3 结果判定:;()8 依据病/f，(j离培养特仲、牛化鉴定、动物接种试验ff出确切诊断5
11、琼脂扩散试验(用于监测免疫效果和追溯性诊断)5. 1 材料准备5. 1. 1 禽霍乱琼脂扩散抗原、标准阳性l虹清和你准阴性血清.按说可1l使用NY /T 563 -2002 5. 1. 2 部液配制，J%硫柳求溶液、pH6.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲(P1IS)浓浓和生理盐水.配制方法见附录Bo5. 1. 3 J自脂板的制备:取pH6.4的。01mol汀.PBS溶液100口叶，放角瓶中，加l人。.8g . 0日琼脂糖.R !氯化饷。三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖3号熔化.再加17llf硫柳辰1mL冷至45( 5() C时，将洁净1热灭菌直径为90mm的平皿置于一平台上.每个平皿bn入1H m
12、L - 20 mL。加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发.放普通冰箱中保存备用(时间不超过2周)。5. 2 操作方法5. 2. 1 打手L在制备的劫、脂板t:.Ill直径4mm的打孔器按六角形图案打孔.或Hl梅花形打孔器打孔。中心孔与外同孔目i离为3mm。将于L中的琼脂用8号钊头斜面向t从右侧边缘插入.轻轻向左侧方向将琼脂挑出.勿伤边缘，避免琼脂层脱离平皿底部。5.2.2 封底111酒精灯轻烤平皿底部到琼脂微熔化为止.封闭孔的底部.以防侧古币15.2.3 加样用微量移液器吸*用灭菌生理盐水(见第B.3章)稀释的抗I#-悬液滴入中归l孔.标准阳性血清分别加入外!司的l、4孔中.标准阴性血清(每批
13、样品仅做次)和受检血清按顺序分别加人外周的2、3、5、6孔中。每孔均以bnl芮不溢出为度.每加一个样品应换个吸头。5.2.4 感作hn样完毕后，静止5min -._, lO min.将平皿轻轻倒置.放人湿盒内晋、17(温箱中反应，分别在24h和48 h观察结果。5. 3 结果判定5. 3. 1 判定方法将坊、脂板置H光灯戎侧强光下观察，标准阳性血清与抗原fL之rbjnl圳-条清晰的白色沉淀线.标准阴性血清与J1原孔之间不出沉淀线.贝IJ试验可成立。5. 3. 2 判定标准5. 3. 2. 1 r.被检血清乱与中心于L之间出现清晰沉淀线.并与阳性血清fL巾心孔之间沉淀线的末端相吻合.IJ1IJ被
14、枪血清判为阳性。5. 3. 2.2 行被检血消孔与中心孔之间不出现沉淀线，但阳性血清孔-U中u于L之间的沉淀线一端在被检血清孔处nJ抗原于LJ向弯曲.则此孔的被检样品JIJ为弱阳性.rti_重复试验.如仍为口I疑.则判为阳性。5.3.2.3 者被检血泊孔与中心孔之间不出现沉淀线.阳性血清孔V中，c.、fL之间的沉淀线在向被检血泊孔.则被枪I也请判为阴性。5. 3. 2.4 若被检Il消于LV中心抗原fL之J沉淀线粗而混浊和标准阳，jIll! 占孔与中心孔之间的沉淀线交叉并IH申.待价血清孔为非特异性反r:v.Ii重复试验.茬仍出现il二特异YI反!市则判为阴啊。判阳I者舰为禽体内存在禽雀乱扩L
15、体。09 NY /T 563 2002 附录A(规范性附录)培养基的配制A.1 5 %鸡血清葡萄糖淀粉琼脂培养基制备1 :1辛且Jt脂(fIi(;11 4789.28 -199111 .1.7规定配制tl) SS mL 3%淀粉溶液1 () mL 髓j萄糖!O民1电JLiN;) mL 将灭l莉的民养掠脂JII热熔化.使冷却到:0C 加l人火菌的淀粉洛液、简110糖皮鸡血清.，昆匀后.倾注平极。A.2 鲜血琼脂培养基制备土J)液|句汤(战Cg4789.28 1991巾.1.1规寇配制)蛋(1陈磷酸氧气仰(K.HPO卢氮化饷(Nal、1) 1 ()OO日1L10 g .。只S g 琼825日灭前h
16、n热熔化，使冷却到50( .加人元菌鸡鲜血达10%，混匀后.倾注平板。B.1 1 %硫柳柔溶液的配制硫柳A-iZ在t自1)(ff解盯.存放备用。附录B(规范性附录)溶液配制。.1 g 100 mL B.2 pH6.4的0.01mol/L PBS溶液的配制可i液:磷n，(二纳(Na，HPO， 12日，0) 110 ，族锵水至乙液.磷酸二氢仰(KH，PO，) 加JAF占!j(主待溶解后分别保存。3.58 g 1 000 mL 1. 36 g I 000 mL N Y /T 563 2002 HlM取甲液24mL、乙液76mL混合即为100mL pH6. 4的().O! mol/LPBS溶液。B.3 生理盐水的配制氯化纳(NaCl) 蒸f阳水前年解后.W中性瓶中灭菌后存放备用8.5 g 1 000 mL :-d
