1、版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1908-2007 泡菜等植物源性食品中寄生虫卵的分离及鉴定规程Protocol of isolation and identification for parasite eggs or oocysts from kimchi and other plant foods 2007-05-23发布2007-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售目。吕本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 1908-20
2、07 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国山东出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:吴绍强、林祥梅、曲径、葛建军、韩雪清、梅琳、刘建、贾广乐、曹际娟、李风琪。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售1 范围泡菜等植物源性食品中寄生虫卵的分离及鉴定规程SN/T 1908-2007 本标准规定了泡菜等植物源性食品中寄生虫卵(包括捆虫Ascaris、钩口线虫Ancylostoma，毛尾线虫Trichuris、毛困线虫Trichostrogylus虫卵和等于包球虫Isops呼oa卵囊等)的分离、形态学鉴定以及捆虫卵
3、的荧光PCR鉴定方法。本标准适用于泡菜、辣椒酱、烤肉酱等植物源食品中寄生虫卵检验时的制样、分离、利用显微镜进行形态学鉴定，以及对检测到的捆虫卵进行荧光PCR准确鉴定。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 f分样increment 从单个取样点一次抽取的少量样品。2.2 原始样品bulk sample 取自同一批的份样，经过1昆合而得到的一定数量样品。2.3 试样test sample 由全部或部分原始样品经进一步均匀化得到的用于分析或测试的样品。2.4 存查样品restore sample 从原始样品中分取的用于备查的一定数量样品。2.5 Ct值cyclethreshold 荧光P
4、CR反应中，荧光信号到达设定的阔值所经历的循环数。3 主要试剂除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。3.1 饱和氧化制溶液取氧化铀(比重1.181. 20)400 g，加于1000 mL水中，加热煮沸至氧化铀完全溶解即可。3.2 0.5%SDS溶液称取SDS(十二皖基磺酸铀)5.0g，加入1000 mL水溶解即可。3.3 荧光PCR鉴定用试剂3.3. 1 捆虫卵荧光PCR检测引物、探针，采用软件BeaconDesigner设计，并进行BLAST分析，验证为阳虫超科寄生虫的通用引物和探针。3.3.2 商品化的Realtime PCR反应预泪液。3.3.3 阳性样品对照:采用猪阳虫雌虫，实验室内解
5、剖，采集子宫部分，采用试剂盒提取基因组D:lA，版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1908-2007 测定含量后，稀释至o.1g/mL，-20oC保存备用。3.3.4 商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。3.3.5 低熔点琼脂糖。3.3.6 液氮04 主要仪器和设备4.1 荧光PCR仪。4.2 高速冷冻离心机。4.3 低速大容量离心机。4.4 液氮罐。4.5 生物显微镜及体视显微镜。4.6 旋涡泪匀器。4. 7 冰箱(20C80C和200C两种)。4.8 麦克马斯特(McMaster)虫卵计数板。4. 9 微量可调移液器(0.1L2L，2L20L、20L2
6、00L、100L1000L等规格)和相应配套的吸头。4.10 40目金属网筛(孔径。.2mm0.3 mm)o 4.11 天平。4.12 三角瓶、慑子、胶头滴管、载玻片、盖玻片等。5 制样除非另有约定，本标准涉及的制样过程一般包括泪合足够量的送检份样组成原始样品，缩分原始样品得到试样和存查样品。将原始样品倒在制样盘(如白色搪瓷盘)内，充分、混合均匀，摊平样品。以对角线四分法缩分出试样和存查样品，每份样品质量约500g 1 000 g 0 应采用规格适宜的容器或包装袋盛装样品并密封。检测样品存查量应至少满足一次检测所需。存查样品的保存条件应依据样品特性确定，为避免样品发生变化以及交叉污染，一般将存
7、查样品密封保存于OOC40C，妥善保留3个月。6 寄生虫卵分离6.1 洗脱取样品200g，泡菜(含液计)等枝叶类样品放入大烧杯内，用1.0 L O. 5%SDS溶液分3次充分清洗每个叶片，合并洗脱液备用;辣椒酱等流体样品可不进行洗脱，直接进行过滤处理。6.2 过滤将洗脱液用40目筛过滤，并用去离子水清洗筛网上的杂物，留取滤液备用。6.3 离心将滤液1500 r/min离心10min，小心倒去上清液，加入去离子水洗涤、1500 r/min离心10min, 2 次，取沉淀备用。6.4 漂浮在沉淀物中加入5倍体积的饱和氧化铀溶液，在旋涡混匀器上泪匀，离心(l500 r/mi口，20min) ，使虫卵
8、上浮于液面。2 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1908-2007 7 形态学鉴定7.1 显微镜检查方法采用切除尖嘴的1.0 mL吸头，与液面平行接触、小心吸取漂浮液顶部的漂浮物，加入McMaster虫卵计数板的计数室内，静置10min，显微镜下检查。先用10X物镜观察，镜检到虫卵后，再改用40X物镜确认。7.2 寄生虫卵的形态学特征7.2.1 线虫卵不同线虫卵的大小和形状不同，常见的为椭圆形、长圆形或圆形。卵壳表面也不一致，有的光滑，有的有结节，有的有凹陷。各种线虫卵的颜色不一致，从无色到黑褐色;线虫卵大多外面有四层膜(光镜下只能见到两层)组成的卵壳，壳内为胚细胞，卵壳的厚薄不同
9、，多数线虫卵壳较薄，捆虫卵壳最厚。有些线虫的卵随粪便排出体外时，已经处于分裂期，有些卵内为幼虫。7.2.2 吸虫卵吸虫卵常为黄色、黄褐色或灰褐色，多数为卵圆形或椭圆形。卵壳有数层卵膜组成，比较厚而结实。大多数吸虫卵的一端有卵盖，卵盖和卵壳之间有一条不明显的缝(新鲜的虫卵在高倍镜下可见)。毛蝴发育成熟后即可顶盖而出;有的吸虫卵没有卵盖，则毛蝴破壳而出。有的吸虫卵表面光滑，有的有各种突出物(如:结节、刺、丝等)。新排出的吸虫卵内，有的为卵黄细胞包围的胚细胞，有的则含有成形的毛蝴。7.2.3 练虫卵缭虫卵大多为无色或灰色，少数为黄色或黄褐色。圆叶目和假叶目缭虫卵的构造不同。国叶目缭虫卵中央有一椭圆形
10、的具有三对胚钩的六钩蝴，六钩蝴包裹在一层膜内，该膜称为内胚膜，内胚膜外还有一层膜，叫外胚膜。内、外胚膜之间常有液体及颗粒状内含物，有的综虫卵的内胚膜上形成突起，称为梨形器(灯泡状结构)。而假叶目综虫的卵在形态和结构上非常接近于吸虫卵。7.2.4 原虫的卵囊多为椭圆形，新鲜的卵囊内为一团原生质，在体外合适的条件下，其内可形成一定数目的子包子囊，囊内有一定数目的子子包子。可根据卵囊中子包子囊的有元、数目和每个子包子囊中子子包子的数目进行初步分类鉴定，具体的种类鉴定必须结合卵囊的构造、大小、寄生宿主、部位及子包子化时间等因素确定。7.3 结果的判断镜检中发现的虫卵，其形态符合7.2中的形态学特征的，
11、即可判断为寄生虫虫卵。8 虫回虫卵荧光PCR鉴定对于形态学分离获得的疑似阳虫卵，可采用琼脂块法进一步分离后，采用荧光PCR准确判定是否为阳虫卵。8.1 操作步骤8.1. 1 捆虫卵分离8. 1. 1. 1 琼脂块的制备:称取低熔点琼脂糖1.0 g，加入100mL三角瓶内，加入100mL ddH20，微波炉加热助溶。采用移液器吸取低熔点琼脂糖并涂布到清洁的载玻片上，厚度大约0.5mmo冷却后，用手术刀片切割成1mm2大小的方块，保鲜膜包裹后40C冰箱放置备用。8. 1. 1. 2 吸取初步鉴定含有捆虫卵的泡菜等样品漂浮液，涂布到制备好的琼脂块上，体视显微镜下，查找到疑似虫卵后，采用解剖针挑取该虫
12、卵所在的琼脂块，加入PCR管内，加入5LddH20 , - 200C 保存。8.1.2 捆虫卵前处理由于阳虫卵外有四层卵壳，应首先破壳才可用于PCR鉴定。方法为将含有疑似阳虫卵的PCR管，版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1908-2007 放入液氮内冷冻1min，然后370C融化5min，如此反复冻融15次后用作荧光PCR反应模板。8.1.3 荧光PCR扩增根据荧光PCR对反应体积的要求，在含有疑似虫卵的PCR管内，选择表1体系之一配置反应液。表1荧光PCR反应液配制试齐。体积/L管内已有水和虫卵5 5 2X荧光PCR反应预混液25 12. 5 虫因虫卵引物及探针(10moljL)
13、1. 5 o. 75 补充灭菌双蒸水至总体积50 25 反应同时设置阳性对照和采用灭菌ddH20作为模板的阴性对照。反应液配好后，旋涡混匀，瞬时离心，将管置于荧光PCR仪内按照如下条件进行PCR扩增:940C 5 min:940C 5 s , 510C 10 s，45个循环。8.2 结果判定反应结束后，I哥值的设定可根据背景值人工调整，以阔值线刚好超过阴性样品扩增曲线的最高点为准。仪器将自动给出每个样品的Ct值。记录Ct值，分析检测结果。8.2. 1 试验成立判定只有阳性对照有扩增曲线，而且Ct30;同时阴性对照扩增曲线Ct30的，才可判定本次试验成立。8.2.2 阳性判定如果样品的PCR扩增
14、曲线Ct30，则表明该疑似物为阳虫卵。8.2.3 阴性判定如果反应曲线Ct二三40，则表明该疑似物不是阳虫卵。8.2.4 可疑判定如果30Ct40，判为可疑，可以加大模板量再重复扩增，如果重复试验的Ct40，则判为阳虫卵，否则不是阳虫卵。8.2.5 无效扩增如果阳性对照没有扩增曲线，或者阴性对照有Ct30的扩增曲线，判定本次试验元效，需要分析并排除引起试验无效的因素，并重新试验。9 检测过程中防止交叉污染的措施应采用公认的措施防止检测过程中交叉污染。由于很多寄生虫为人兽共患病原，实验操作过程中要注意人员的防护。4 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1908-2007 附录A(规范性附
15、录)检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施A.1 样品处理过程中应戴一次性子套，并经常更换。PCR反应液配制过程中应在超净工作台等洁净环境中进行。A.2 抽样和制样工具应清洁干净，且用于试验的器皿和离心管、PCR管等必须经过121c、15min高压灭菌后才可使用。A.3 引物、探针等、溶液应按照实际工作浓度一次性溶解好，并分装后使用，防止试验过程中污染。A.4 试验前后，要把超净工作台的紫外灯打开，以破坏可能残留的DJA，A.5 上机运行前应检查各PCR管盖是否盖紧，以防荧光物质泄露而污染机器。5 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1908-2007 图B.1固B.36 附录B (资
16、料性附录)可能造成污染的几种寄生虫卵的显微镜下形态学特征似蚓捆线虫卵毛圆线虫卵图B.5图B.2图B.4，; /警飞/肝毛细线虫卵、喜喜剧 钩虫卵等于包球虫卵y 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售khCON-。由-问Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准泡菜等植物源性食品中寄生虫卵的分离及鉴定规程SN/T 1908-2007 -兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当咛开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数14千字2007年9月第一版2007年9月第一次印刷印数1-2000 定价8.00元-兴书号:155066.2-18052 SN/T 1908-2007
