1、版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1918-2007 牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction for infectious bovine rhinotracheitis 2007-05-23发布2007-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检度总局版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售目。吕本标准参考了。IE(陆生动物疫病诊断i式验和疫苗标准子册上本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 1918-2007 本标准起草单
2、位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人:段宏安、张睿、姚燕林、王振国、周毅、王海涛、王伟利、李金华、刘小琴。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售1 范围牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应操作规程本标准规定了牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应检测方法。本标准适用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。2 规范性引用文件SN/T 1918-2007 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否
3、可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和民验方法CeqvISO 3696: 1987) GB/T 18088 出入境动物检疫采样SJ/T 1193 基因检验实验室技术要求3 缩略语3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3. 7 下列缩略i吾适用于本标准。IBR infectious bovine rhinotracheitis 牛传染性鼻气管炎。BHV 1 bovine herpesvirus type 1 牛擅摩病毒1型。MDBK Madin-Darby bovine kidney cell line 牛肾传
4、代细胞系。PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应。BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白。dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核昔二磷酸。dATP deoxyadenosine triphosphate 脱氧腺昔三磷酸。版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1918-2007 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 dCTP deoxycytidine triphosphate 脱氧胞昔三磷酸。dGTP deoxyguanosine triphos
5、phate 脱氧鸟昔三磷酸。dTTP deoxythymidine triphosphate 脱氧胸昔三磷酸。bp base pair 碱基对。ddH20 double distilled water 双蒸水。EDTA ethylene diaminetetraacetic acid 乙二肢四乙酸。Taq酶TaqDNA polymerase T叫DJA聚合酶。CPE cytopathic effect 致细胞病变效应。4 原理牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛殖磨病毒1型(BHV1)引起的牛的急性病毒性传染病。患牛康复后仍可长期带毒，生殖系统感染后，病毒可在阴道及包皮粘膜中繁殖，精液中可能含有病
6、毒。通过对采集病料的处理，提取病毒DJA，以病毒gB和gE基因片段为靶基因进行PCR扩增;琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，以确定样品中是否含有BHVl病毒。5 试剂和材料除另有规定外，水为双蒸水或超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格，并经过121C、30min高压灭菌;试剂为分析纯或生化试剂。5.1 琼脂糖(电泳纯)。5.2 漠化乙链(EB)。5.3 三氯甲:院。5.4 异戊醇。5.5 异丙醇。5.6 75%乙醇。5. 7 正丁醇。5.8 1飞叫酶:-20C保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。5.9 DJA分子量标准(DNA Marker) : 50 bp 500 bp，须在250bp、
7、500bp处各有一条带。版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1918-2007 5.10 PBS(pH7.2)榕液、红细胞裂解液、5% Chelex-1 00榕液、精子裂解液、TE缓冲液、dNTP、引物、10XPCR反应液、电泳缓冲液、10X加样缓冲液、澳化乙链核酸染色液配制方法参见附录A，6 主要仪器6.1 PCR扩增仪。6.2 元菌室、超净工作台或通风橱。6.3 1肖毒灭菌锅。6.4 恒温水浴箱。6.5 高速冷冻离心机。6.6 台式小型离心机。6. 7 低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。6.8 纯水器或超纯水器。6.9 旋涡混合器。6.10 移液器。6.11 电泳仪。6.12 紫外分析仪或凝
8、胶成像系统。6.13 pH 计。6.14 组织研磨器或子持式均质器。7 操作方法7.1 样品处理及病毒DNA提取7. 1. 1 临床样品处理:临床取鼻拭子、阴道拭子等，剖检取病变组织。拭子样品悬于PBS，放入少量玻璃珠，旋涡混合，1000 r/min离心5mi口，取上清备用;组织样品取3g置于5mLPBS中均质，1 000 r/min离心5mi口，取上清备用。7.1.2 血凝块及全血处理:取出装有血凝块的采血管，将于持式均质器的均质头置入灭菌双蒸水中清洗后，浸入无水酒精中清洗，于火焰上烧灼至干，浸入灭菌PBS中冷却，置于血凝块中均质，直至无团块状物存在。全血(抗凝血)不需均质处理，全血及血凝块
9、均质液加入红细胞裂解液至满管，充分?昆匀，置于冰上15mi口，1600 r/min2 000 r/min离心5mi口10mi口，去上清液，如沉淀仍有血凝块，可用红细胞裂解液反复裂解直至无血凝块存在，细胞沉淀用PBS洗涤一至二次后，加入1倍体积的PBS悬浮细胞备用。7. 1. 3 细胞培养物处理:取接种样品后出现CPE或可疑的细胞培养物三次冻融，取细胞悬液500L，经2000 r/min离心10mi口，去上清液，取沉淀备用。7.1.4 前处理后样品中病毒DJA提取:取另一支灭菌的微量离心管，按不同样品加入上述处理好的样品和5% Chelex-1 00溶液:临床样品上清液50L，5%Chelex-
10、100溶液150L;血凝块及全血样品制备的细胞悬液100L，5 % Chelex-100溶液100L;细胞培养物离心后的沉淀可直接加入5%chelex 100溶液200L，旋涡混匀，56C60C孵育20min，旋涡混合10s，98C水浴8min 10 min，旋涡混合10 s，置于冰上冷却3mi口，15000 r/mi口离心2min，取上清液5L用于PCR反应。剩余部分置于4C短期或20C长期保存备用。7.1.5 精液中病毒DJA提取:用火焰上烧灼过的剪刀将冻精管剪断，将精液(约150L)收集于1. 5 mL离心管中，取100L精液用于DJA提取，加入等量桔子裂解液，置于60C1 h , 12
11、 000 r/mi口离心30s，上清液中加入等量的6mol/L NaCl , 1.昆合5S，室温下静置5mi口，由合物中加入1.4倍的三氯甲皖:异戊醇(24: 1)，1昆合1min, 12 000 r/mi口离心5mi口，上清液中加入O.6倍体积的异丙醇，12 000 r/min室温下离心15mi口，沉淀用正丁醇纯化，沉淀重悬于100LTE缓冲液，加入10倍体积的版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1918-2007 正丁醇，12000 r/min室温下离心3min，最终沉淀溶于50LTE中，通常取10L用于PCR。7. 1. 6 样品中病毒D:-.JA的提取可选用其他合适DNA抽提方
12、法或商品化试剂盒提取病毒D:-.JA，7.1.7 检测过程中防止交叉污染的措施按照S:-.J/T1193中的规定执行。7.2 PCR 1ftl曾7.2.1 反应体系体积为50L:d:-.JTPClOmmol/L)1L， Jl物(各10mol/L)各O.5L、10XPCR缓冲液5LJaqD:-.JA聚合酶(5U/L)0.5L、模板DNA(0.1gl.0g)10L，Jj( 33L。使用不同PCR扩增仪，可对参数作适当调整。7.2.2 反应条件:反应在PCR扩增仪中进行，首先在94C预变性3mi口，随后在96C变性1mi口，60C退火45s，72C延伸45s条件下进行10个循环，在96C变性1min
13、，54C退火45s，72C延伸45s条件下进行15个循环，然后在96C变性1min，57C退火45s , 72C延伸45s条件下进行10个循环，经72C延伸10min结束反应，反应条件对不同PCR扩增仪可经反复优化确立。7.2.3 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用含BHV1病毒的细胞培养悬液和正常MDBK细胞培养物按7.1. 3和7.1. 4提取D:-.JA分别作阳性对照和阴性对照，空白对照除以双蒸水代替模板外，测定步骤相同。7.3 琼脂糖;疑胶电泳取0.5g，于25mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入漠化乙链至终浓度为1g/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过
14、凝胶。将10LPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液泪合，点样。9V/cm恒压，电泳20min30 mi凡紫外检测仪下观察电泳结果并记录。8 结果判定8.1 PCR扩增产物电泳检测结果:BHV1的gB基因PCR扩增产物为491bp;BHV1的gE基因PCR扩增产物为271忡。8.2 PCR扩增产物电泳未出现特异性条带时，未检出BHV1病毒。8.3 PCR扩增产物电泳两者之一或均出现特异性条带，检出BHV1病毒。8.4 必要时，进行PCR扩增产物测序，进行确认试验，具体步骤和参考序列参见附录B。与参考序列的同源性在95%以上者，可确证阳性结果。4 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售A.1 PBS溶液
15、附录A(资料性附录)试剂配制SN/T 1918-2007 氯化专内(NaC1)8.5g，氧化何(KCl)0.2 g，磷酸氢二铀C.Ja2HP01 12H20)2. 85 g，磷酸二氢梆(KH2 PC )0.27 g，定容至1000 mL双蒸水中，调pH至7.2，灭菌备用。A.2 红细胞裂解液0.15 mol/L JH4CI-0. 01 mol/L KHCO,-O. 001 mol/L Na2-EDTAc A. 3 5 % Chelex-100溶液称取5g Chelex-100，定容至100mL蒸馆水中，移取时，边搅拌边用灭菌的1000L吸头移取，必要时，可将灭菌吸头尖部用灭菌剪刀剪掉，以移取时
16、可吸取胶珠且不流出为宜。A.4 精子裂解液150 mmol/L氯化纳(NaCl), 0.75 %月桂眈基肌氨酸铀，1.5 mg/mL蛋白酶K，40 mmol/L DTT A.5 TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA,pH 8.0。A.6 dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)将同样浓度的dATP、dTTP、dCTP和dGTP等体积混匀，制备成所需浓度的dJTPs，使用浓度为10 mmol/L A.7 引物使用浓度为10mol/L，分别为:gBl :5-TAC GAC TCG TTC GCG CTC TC-3 gB2:5-GGT ACG TC
17、T CCA AGC TGC CC-3 gE1:5-GCT TCG GTC GAC ACG GTC TT-3 gE2:5-CTT TGT CGC CCG TTG AGT CG-3 A.8 10 X PCR缓冲液(含MgCl2) 100 mmol/L氯化饵(KCl), 160 mmol/L硫酸锻(NH1)2S01 , 20 mmol/L硫酸镜(MgS01), 200 mmol/LTris-HCl(pH8.的，1%TritonX-100 , 1 mg/mL BSA , 25 mmol/L氯化镜(MgC12)。A.9 电泳缓冲液(5X TBE) Tris 54 g，棚酸27.5g , O. 5 mol
18、/L EDTA(pH8. 0)20 mL，加蒸馆水至1000 mL，用双蒸水稀释成1XTBE 使用。5 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1918-2007 A.10 10 x加样缓冲液含0.25%澳酣蓝和40%庶糖的水溶液。A.11 漠化乙链核酸染色液用双蒸水配制成10mg/mL的浓缩液，用时每100mL琼脂糖中加10L。6 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1918-2007 附录B(资料性附录)确证试验一-PCR产物泪IJ序B.1 gB扩增产物序列ACCCGTACGA CTCGTTCGCG CTCTCGACCG GGGACATTAT CTACATGTCG CCCTTT
19、TACG GGCTGCGCGA GGGCGCGCAC CGCGAGCACA CCAGCTACTC GCCGGAGCGC TTCCAGCAGA TCGAGGGCTA CTACAAGCGC GACATGGCCA CGGGCCGGCG CCTCAAGGAG CCGGTCTCGC GGAACTTTTI、GCGTACACAGCACGTGACGG TAGCCTGGGA CTGGGTGCCC AAGCGCAAAA ACGTGTGCTC GCTGGCCAAG TGGCGCGAGG CGGACGAAAT GCTGCGAGAC GAGAGCCGCG GGAACTTCCG CTTCACGGCC CGCTCGCTCT
20、 CGGCGACCTT TGTGAGCGAC AGCCACACCT TCGCGTTGCA GAATGTGCCG CTGAGCGACT GCGTGATCGA AGAGGCCGAG GCCGCGGTCG AGCGCGTCTA CCGCGAGCGC TACAACGGCA CGCACGTGCT GTCGGGCAGC TTGGAGACGT ACCTGGCGCG B.2 gE扩增产物序列GCTTCGGTCG ACACGGTCTT CACGGCGCGC GCTGGCGCGC CCGTCTTI、CTCCCAGGGCCC GCGGCGCGCC CGGACGTGCG CGCCGTTCGC GGCTGGAGCG T
21、CCTCGCGGG CGCCTGCTCG CCGCCCGTGC CGGAGCCCGT CTGCCTCGAC GACCGCGAGT GCTTCACCGA CGTGGCCCTG GACGCGGCCT GCCTGCGAAC CGCCCGCGTG GCCCCGCTGG CCATCGCGGA GCTCGCCGAG CGGCCCGACT CAACGGGCGA CAAAGAGTTT 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售khCON-问Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应操作规程SN/T 1918-2007 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045-兴网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当咛开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数14千字2007年9月第一版2007年9月第一次印刷印数1-2000 定价8.00元-兴书号:155066.2-18061 SN/T 1918-2007
