1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1933.2-2007 食品和水中肠球菌检验方法第2部分:滤膜法2007-05-23发布Detection of Enterococci in food and water一Part 2: Method for membrane filtration 2007-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局目。吕SJ/T 1933(食品和水中肠球菌检验方法分为两个部分:第1部分:平板计数法和最近似值测定法;第2部分:滤膜法。本部分为SN/丁1933的第2部分。本部分的附录A是资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分
2、由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局负责起草。本部分主要起草人:郑秋月、曹际娟、王芳、赵昕、于灵、马慧疏。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1933.2-2007 1 范围食品和水中肠球菌检验方法第2部分:滤膜法S:-.J /T 1933的本部分规定了水和液体饮料中肠球菌检验滤膜法。SN/T 1933.2-2007 本部分适用于生活用水、生产加工用水、废水及茶饮料、碳酸饮料等液体饮料中肠球菌的检验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1933的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，
3、鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法S:-.J /T 0330 出口食品中微生物学检验通则3 方法提要一定数量液体样品或样品稀释液通过滤膜时，细菌被截留在滤膜上。将滤膜置于选择性培养基上培养后，肠球菌菌落呈现特定颜色。经过肠球菌菌落确证实验后，计数并计算滤膜上阳性肠球菌菌落数，即可检验出样品中肠球菌数目。4 术语、定义和缩略语S:-.J/T 1933.1确立的术语、定义和缩略语适用于SN/T1933的本部分。5 设备和材料5.1 电子天平:感量为0.001go 5.2 恒温
4、培养箱:41c士O.5C ，35C士0.5C，45C士O.5C 0 5.3 振荡器。5.4 移液管:容量1mL, 10 mL。5.5 培养皿:9X50mm，直径90mmo 5.6 玻璃、耐高温塑料、陶器或不锈钢过滤器。5. 7 抽滤瓶。5.8 真空泵。5.9 滤膜:直径47mm，微孔径O.45m士0.02mo6 培养基和试剂实验用水符合GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法的要求。除另有规定外，式剂为分析纯。6.1 mEI琼脂(见第A.1章)。6.2 胆计七叶昔琼脂(BEA琼脂)(见第A.2章)。SN/T 1933.2-2007 6.3 脑心浸液肉汤(见第A.3章)。6.4 含6.5%N
5、aCl脑心浸液肉汤(见第A.4章)0 6.5 脑心浸液琼脂(见第A.5章)。6.6 缓冲蛋白陈水(见第A.6章)。7 样品制备7.1 抽样数量及抽样方法抽样数量及抽样方法按SN/丁0330进行。7.2 样品的贮存和运送采样后应尽快进行检验，冷冻样品如不能立即进行检验，应置于180C保存。应冷藏保存的待检样品在运送实验室过程中应于lOC40C保存。样品采集后8h之内要完成检验。7.3 制样7.3. 1 污染程度低的水及液体饮料可以直接进行检验。7.3.2 污染严重的水及液体饮料可吸取25mL样品，加入225mL缓冲蛋白陈水中，充分泪匀，制成1 : 10样品匀液。7.3.3 以上样品制备可根据样品
6、污染程度及检验需要，进一步制成10倍递增的样品稀释液。8 检验程序水和液体饮料中肠球菌滤膜法检验程序见图L样品原液或适当倍数稀释液样品过滤mEl琼脂41c士O.5 c 21 h :1: 1 h 取带蓝色晕轮的菌落进行确证实验固1食品和水中肠球菌滤膜法的检验程序示意图2 9 检验步骤与计数9.1 培养基平板制备制备mEI琼脂培养基(见第A.1章), 9.2 样品量的选择SN/T 1933.2-2007 根据样品污染情况，选择适宜稀释度的样液。样品加样量在1mL100 mL之间按半对数间距选择(例如:加样100mL、30mL、10mL、3mL)，以能在滤膜上生长出20个60个菌落为宜。每个样品至少
7、选择三个加样量进行过滤。9.3 样品过滤将灭过菌的过滤装置连接到抽滤瓶上，用无菌摄子夹取滤膜，将滤膜放至滤器底部。无菌吸取样液至滤器内，打开真空泵进行抽滤。当全部样液通过滤膜后，用20mL30 mL灭菌生理盐水轻洗滤器边缘至少两次。关闭真空泵，打开滤器，用无菌慑子移取滤膜。9.4 接种与培养将己滤过样液的滤膜紧贴在mEI琼脂表面上，防止滤膜与琼脂间产生气泡，如有气泡产生，重新放置滤膜。倒置平板于41C士0.5C培养24h士1h, 9.5 菌落形态观察肠球菌在mEI琼脂平板的滤膜上形成带有蓝色晕轮的菌落。9.6 确证试验9.6. 1 用灭菌接种针从滤膜上至少挑取10个带有蓝色晕轮的菌落(不必考虑
8、菌落本身颜色，只要是带有蓝色晕轮的菌落即可)进行确证试验。菌落分别接种到BHIB肉汤和BHIA斜面，BHIB肉汤置35C士0.5C培养24h士1h，BHIA斜面置35C士0.5C培养48h士1h, 9.6.2 BHIB肉汤培养24h :l: 1 h后，每管肉汤培养物分别接种到相应BEA平板、BHIB肉汤及含6.5%氧化铀的BHIB肉汤中。BEA平板及含6.5%氧化铀的BHIB肉汤置35C士0.5C培养48h士1h; BHIB肉汤置45C士0.5C培养48h士1h，观察细菌生长情况。9.6.3 BHIA斜面培养48h士1h后，从斜面上挑取菌落作革兰民染色。9.6.4 革兰氏染色镜检为革兰民阳性球
9、菌;在BEA平板上生长并水解七叶昔(形成黑色或棕色沉淀hBHIB肉汤中45C士0.5C生长;并且在含6.5%氧化铀的BHIB肉汤中35C士0.5C生长良好;具有以上特性的典型菌落可确证为肠球菌。9. 7 肠球菌的计数对确证为肠球菌菌落的滤膜进行计数，生长有20个60个肠球菌的滤膜为计数合适范围。9.8 肠球茵茵数的计算根据所使用的样品量，按照式(1)，计算每100mL样品中肠球菌菌落数。肠球菌菌落数X100 肠球菌/100mL二一-. . 一-. ( 1 ) 10 结果报告肠球菌:CFU/100mL, 3 SN/T 1933.2-2007 A.1 mEI五京H旨A.1.1 成分蛋白陈氧化纳七叶
10、昔放线菌自同叠氮化专内酵母浸膏D呵|喋葡糖昔琼脂蒸锢水A. 1.2 制法10.0 g 15.0 g 1. 0g 0.05 g 0.15 g 30.0 g 0.75 g 15.0 g 1 000.0 mL 附录A(资料性附录)培养基将以上各成分加热溶解，1210C高压灭菌15min，在500C水浴中冷却。在5mL蒸馆水中加0.24g 荼眩目同酸，滴加几滴0.1mol/L的氢氧化纳，配制荼眩目同酸溶液，将此榕液加入mEI琼脂中。再加入0.02 g无菌氧化三苯四氮瞠(TTC)，充分?昆匀。调节pH值至7.1士0.20倾注约4mL6 mL的mEI琼脂至9X50mm的平板，琼脂厚度约4mm5 mmo平板
11、冷藏备用。A.2 胆汁七叶昔琼脂A. 2.1 成分蛋白陈胆汁盐拧橡酸铁七叶昔琼脂蒸馆水A. 2. 2 制法8.0 g 20.0 g 0.5 g 1. 0g 15.0 g 1 000.0 mL 将各成分加热溶解，1210C高压灭菌15mi口，调节pH值至7.1士0.2。冷至450C50oC倾注平板。A.3 脑心浸液肉汤(BHIB)A. 3.1 成分4 牛脑浸出粉牛心浸出粉膜蛋白陈葡萄糖氯化纳磷酸氢二铀蒸馆水10.0 g 9.0 g 10.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 1 000.0 mL SN/T 1933.2-2007 A. 3. 2 制法将各成分加入蒸馆水中，加热溶解，调节pH
12、至7.4士0.2，分装，121c高压灭菌15mino A.4 含6.5%氢化铀(NaCI)脑心浸液肉汤A. 4.1 成分除加入氯化铀(NaCl)，其余成分与BHlB肉汤相同OA. 4. 2 制法每升BHlB肉汤中加60.0g氧化纳(NaCl)，其余制法与BHlB肉汤相同。A.5 脑心浸液琼脂A. 5.1 成分除每升BHlB肉汤加15.0g琼脂，其余成分与BHlB肉汤相同。A. 5. 2 制法称取52g BHIA 溶于1000 mL蒸馆水中，加热溶解，每管分装10mL , 121C高压灭菌15mi口，制备成斜面，调节pH至7.4士0.20A.6 缓冲蛋白脏水A. 6.1 成分蛋白陈氯化纳磷酸氢二
13、铀磷酸二氢饵蒸悟水A. 6. 2 制法10.0 g 5.0 g 9.0 g 1. 5g 1 000.0 mL 按上述成分配好后，调节pH至7.2，每瓶分装225mL, 121C高压灭菌15mino 5 hCON-N.肉的白二军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食品和水中肠球菌检验方法第2部分:滤膜法S:f/T 1933.2-2007 -兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当咛开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数11千字2007年9月第一版2007年9月第一次印刷印数1-2000 定价8.00元-兴书号:155066.2-18077 SN/T 1933.2-2007
