1、中华人民共和国国绿标准食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验Microbiological examination of food hygiene Examination of Listeria monocytogenes 1 主题内容与适用范围本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2 引用标准GB 4789. 28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料3. 1 温箱30和25。3. 2 天平。3. 3 500 mL一角瓶。3. 4 接种环。3. 5接种针。3.6载玻片。3. 7 盖玻片。3.8 显微镜
2、或相差显微镜。3. 9 平皿。3. 10试管。3. 11 均质器。3. 12无菌注射器。3. 13 吸管，1mL,10 mL. 3. 14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。3. 15 马红球菌。4 培养基和试剂4. 1 含0.6%酵母浸膏的膜酶大豆肉汤（TSR-YE)z见附录Al。4.2 含0.6%酵母浸膏的膜酶大豆琼脂（TSAYE），见附录A2.4. 3 EB增菌液2见附录A3.4. 4 LR增菌液化矶，LB，），见附录A4。4. 5 兰糖铁（TSI）琼腊，GB4789. 28中4.26,4.27。中华人民共和国卫生部1994-03-18批准326 GB 4 7 8 9. 3 0 94 199
3、4 09-01实施GB 4789. 30 94 4. 6 SIM动力培养基见附录A5.4. 7 血琼脂，GB4789. 28中4.6 0 4. 8 改良的McBride(MMA）琼腊见附录A5.4. 9硝酸盐培养基，GB4789. 28中3.17。4. 10缓冲葡萄糖蛋白陈水（MR和VP试验用）,GB 4789. 28中3.4。4. 11 糖发酵培养基，GB4789. 28中3.2。4. 12 过氧化氢酶试验，GB4789. 28中4.38。4. 13 盐酸口丫睫黄（AcriflavineHCl) (Sigma）。4. 14 茶晓嗣酸纳盐（Naladixicacid) (Sigma）。检验程序
4、5 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下捡样25gLB，增菌液225mLEB增菌液225mL增菌30C .24h 30，48h7d LB，增菌液tomL30，24h 选择性培基（MMAl 30C. ts 24h TS！琼脂SIM动力培养基分离培养30，24h 2Sd（伞状25 TSA YE培养基纯培养确证试验协溶七鼠木甘过鼠同血叶李糖露氧致榕试昔糖醇化病血验氧力试酶硝酸盐还原试验显革微二忌LVP 镜氏试下m 验观色试327 验试验试验事运动GB 4789. 30 94 6操作步骤6. 1 样品的收集及处理无菌采联样品25g(mL）放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不
5、能及时检验，可暂存4冰箱。6.2 增菌培养EB增菌液放30士1培养48h 7 d ,LB，增菌液225mL放30士l，培养24h，取出0.1 ml，加入10mL LB，增菌液中二次增菌。6.3 分离培养将EB增菌液和LB，二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30土148h，挑选可疑菌落，用白炽灯45。角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形的菌落。6.4 选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁（TS！）琼脂和SIM动力培养基，培养于25士1，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。般观察27d，阳性者可做下步鉴定。6. 5 纯培养将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上
6、层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于膜酷陈大豆琼脂培养基（TSA-YE)K，做纯培养供做以下鉴定。6.6 染色镜检将上述可疑纯培养物做草兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为0.4 0. 5 m o. 52.0m；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。6. 7 生化特性将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有关菌的区别见表1 表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别菌种溶血反应硝酸盐还原尿素酶MR VP 甘露醇鼠李糖本糖七叶背单核细胞增生李斯特氏菌+ (L. monocytogenes
7、) +/+ + 十绵羊李斯待氏菌+ (L. ;vanov;) 十十+ 十英诸克李斯特氏蘑十十v + (,. ;nnocua) 威尔斯李斯特氏菌十v + 十(,. welsh;mer;) 西尔李斯特氏菌十十+ + (, seeUger;格氏李斯特氏菌十十一十+ (L. gray;) 默氏李斯特氏菌+ 十十v + (L. murray;) 注EV反应不定，十阳性g阴性。328 GB 4789. 30-94 6.8 对小鼠的致病力试验将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，在30培养24h，离心，浓缩，使浓缩液每毫升10 /mL个细菌，取o.5 mL浓缩菌液注射小白鼠腹腔，35只，观察小鼠死亡
8、情况。致病株于25d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。6. 9协同溶血试验（cAMP)在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌（R.equ仆，在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，在30培养2448h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，而绵羊李斯特氏商在马红球菌附近的溶血增强，有助于鉴别。329 . GB 4789. 30 94 附录A培养基（补充件）Al 含Q.6%酵母漫膏的腕酶陈大豆肉汤（TSB-YE)A 1 1 成分膜陈17 g 多价陈
9、3日酵母膏6g 氯化制5g 磷酸氢二饵2. 5 g 葡萄糖2. 5 g 蒸馆水1 000 mL A 1 2 制法、将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.2 7. 4，分装，121灭菌15min，备用。A2 含o.6%酵母膏鹏酷陈大豆琼脂（T百A-YE)A2. 1 成分膜脐、17 g 多价陈3 g 酵母膏8g 氯化制5 g 磷酸氢二饵2. 5 g 葡萄糖2. 5 g 琼脂15 g 蒸馅水I 000 mL A2. 2 ljjlj法将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2 7. 4，分装，121高压灭菌，备用。A3 EB增菌液A3. 1 成分膜陈17 g 多价陈3g 酵母膏6 g 330 . GB
10、4789. 30 94 氯化销5 g 磷酸氮二御2. 5 g 葡萄糖2. 5 g 蒸馆水1 000 mL 盐酸町晓黄15 mg/L 茶睫翻酸40 mg/L A3. 2 司司法除n丫晓黄和茶晓酬酸外，其余成分加热混合调pH至7.2 7. 4,12115 min高压灭菌。使用前加盯晓黄溶液15mg/L和茶晓嗣酸溶液40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。A4 李氏增菌肉汤（LB,LB2) A4. 1 成分膜脐5g 多价陈5 g 酵母膏5g 氯化纳5g 磷酸二氢饵1. 35 g 磷酸氢二锅12 g 七叶管1 g 蒸缩水1 000 mL A4. 2制法将上述成分加热溶解，调pH至7.27.4，分
11、装，12115min高压灭菌。A4. 2. 1 李氏I液（LB,)225mL中加入：1%茶院嗣酸（用0.05 mol/L氢氧化销溶液配制tll0.45 mL 1%P丫晓黄（用灭菌蒸馆水配制）0. 27 mL A4. 2. 2 李氏E液化乌）200mL中加入z1%茶晓酣酸p.40 mL 1%町晓黄0. 50 mL 无菌分装于10mL大试管中。A5 改良的McBride琼脂（MMA)A5. 1 成分膜胶、。E多价陈5 g 牛肉膏3g 葡萄糖1 g 331 GB 4789. 30 94 氯化纳5g 磷酸氢三销1 g 苯乙醇2. 5 mL 无水甘氨酸10 g 氯化鲤0. 5 g 琼脂15 g 蒸饱水1
12、 000 mL A5. 2 制法将上述成分加热搅拌混匀，调pH至7.27.4，分装，12115min高压灭菌，备用。A6 SIM动力培养基A6. 1 成分膜豚20 g 多价陈6g 硫酸铁镀0. 2 g 硫代硫酸销o. 2 g 琼脂3. 5 g 蒸馆水1 ooo mL A6. 2 4司法将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，高压灭菌12115min0 附加说明：本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准主要起草人白竟玉、付薄、李志刚。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。本标准参照采用美国食品药品管理局（FDAJ细菌学分析手册（第六版）增补材料第二十九章李斯特氏菌部分（1987）。332
