1、GB!T 18086-2000 前占2口烟霜霉病是我国进境植物检疫危险性病害，为了防止该病菌随寄王传入我国.在进境检疫时，需正确掌握烟霜霉病菌的检疫鉴定方法。本标准在制定过程中，经过调查研究，分析有关资料和总结多年的实践经验，以及根据烟霜霉病菌的生物学特性、病理学原理，确定各项技术指标。本标准给出烟霜霉病病原菌的抱囊梗和于包囊及卵袍子的形态特征，两者可同时或单强作为烟霜霉病菌的鉴定依据。本标准的附录A是提示的附录，附录中的冰冻匀浆法是检验烟霜霉病菌卵抱子的一种较先进的方法.但目前在圈内尚未普及，故在检验烟霜霉病菌时，若条件允许，也可采用此法检验该病原产生的卵袍子。本标准由农业部提出。本标准负责
2、起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:李怡珍、章正、钟国强、张传飞。1()5 中华人民共和国国家标准植物检疫烟霜军病菌检疫鉴定方法GB/T 18086- 2000 Plant quarantine-Methods for inspection and identification 。fPeronospora hyoscyami de Bary f. sp. tabacina (Adam) Skalichy 1 范围本标准规定了进境植物检疫中对烟霜霉病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进境干烟叶和烟属植物种子、种茵的烟霜霉病菌检疫和鉴定。2 原理烟霜霉病菌为专性寄生菌，烟叶
3、被侵染为害后，出现边缘模糊、褪绿的近圆形斑点，后期形成淡褐色可脱落的坏死病斑。在适宜温湿度条件下，叶背面病斑长出淡蓝色霉状物.即烟霜霉病菌的抱囊梗和子E囊;在一定条件下，病组织内可形成卵ffi!子。病原菌的寄生专化性及其形态学特征是鉴定烟霜霉病菌的依据。3 仪器、试剂3. 1 手持扩大镜。3. 2 带光源的扩大镜。3. 3 双目解lftJ镜OOX50X)。3. 4 显微镜OOOX1 OOOX)。3. 5 离心机(1000 r/min4 000 r/min)。3. 6 不锈钢筛(孔径60m)。3. 7 振荡器(200r/minl。3. 8 。.02mol/L磷酸缓冲液(pH7)。3. 9 苯胶蓝
4、。3. 10 乳盼油乳盼油配制:苯盼结晶(水浴加热溶化)20mL、乳酸20mL、甘油40mL、蒸馆水20mL混合而成。3. 11 10%氢氧化御溶液氢氧化梆溶液配制z取氢氧化锦10g，加水90mL溶解配成10%氢氧化饵溶液。4 抽样4. 1 抽查取样前查验待检烟叶的有关单证，核实产地、包装、暧头、品名、级别、收获年份及数量。4.2 用随机方法在货柜车、船舱、仓库堆位的上、中、下各层开件抽查，检查包内烟叶是否有可疑疫情，随机在包内的各个部位取样，注意抽取等级差、叶色暗淡无光泽的烟叶带回室内检验。4.3 抽查件数国家质量技术监督局2000-04斗26批准2000-10-01实施才06GB/T 18
5、086-2000 *货物批量总件数o.5%10%开件抽查取样，500件以下的抽查20件，少于20件的全批抽查。其余开件抽查件数如表1, 表1进境烟叶检疫抽查表批量巴件数，件抽查件数，件500以FC含，00it) 20 5011 000 21 30 1 0(1 1 3 000 31 40 300150 .n .-. 50 5 001.-.10 000 5170 10001以上71100 4.4 取样质量番料烟、打叶片烟每批取祥6kg 15峙。扎把烟每批取样20kg40险。4. 5 烟属种子、种苗的抽样每批按总件数的5%20%抽查，种子每批取样检验20g50 g，种苗每批取样检验100株以上，少于
6、100株的全检。5 烟叶检验方法5. 1 病叶检查在光线充足处，逐片检查烟叶有无烟霜霉病的可疑症状，叶背有无灰褐色的霜每层。5. 2病原菌检验5. 2. 1 亘接镜检用解剖针挑取病斑上的霉状物制片镜检，用显微镜观察有无病原菌的泡囊梗和:i1!l囊，记录其形态特征，必要时测量也囊梗的长度和抱囊的大小。5. 2. 2 洗澡检验将未发现霜霉层的可疑病斑及碎片，置250时，三角瓶内，加入适量蒸饱水浸软后.用振荡器激烈震荡5min，洗下病斑表面的病原物.将洗涤液倒进离心管，以1000 r/min离心5min，倾去上层清液，取沉淀液置载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜检查有无烟霜霉病菌的泡囊梗和泡囊，每批样品
7、至少检查10个玻片。5. 2. 3 叶组织透明法检验卵抱子选取病叶上霉状物稀少的老病斑置于小烧杯中，加适量10%氢氧化梆溶液(或其他叶组织透明试剂)，煮沸5min.-.-10 rnin至叶组织透明，加0.05%苯胶蓝(棉蓝)乳盼油作浮载剂，置显微镜下逐片观察有无卵子包子。5. 2. 4 冰冻匀浆法检验卵子包子见附录A)5.3 样品的保存经检验完毕的大宗烟叶的样品，香料烟、打叶片烟等每批留样1kg2 kg，1L把烟每批留样2kg 4 kg，注明烟样的合同号、产地、品名、级别、收获年份、抽样地点、时间等项目后分别存放于干燥、防虫处保存2个月。发现有烟霜霉病叶的样品，至少保存6个月，以备复检、谈判和
8、仲裁。保存期满后需作灭菌处理。E 烟属植物的种子、种苗检验方法6. 1 种子检验随机选取神子10g30 g(含种子中夹杂的残株碎屑)，用5.2. 2条方法洗涤检验(该方法主要检验307 GB/T 18086 2000 夹杂在种子中的残株碎!离;%奋斗智娴稻草草菌的泡裳梗和南囊)。6. 2 种商检验将在f中茵叶片背顶有无知丑辛苦草草病症状，如有意霉层.可用5.2. 1条方法镜核病原的但囊烦和抱囊句对可疑烟前，须11保混1金交3将可凝烟吉!fut片展芋.)汶入预制的J:径15cm-._, 20 cm铺有3层混滤纸的玻i盟中，瓶盖1言形成小主I京-i景18C下无光照洗发主苦养12h24 h.然后在双
9、目镜下仔细检查有无新生命荒岛事言霉病的范囊穰辛苦于起囊。7 鉴定特征熠霜霉病密的范辈革然无毯，从寄空气孔中体出，主辙较稳;险，上部呈双叉分校3次l口次oll褒楼长400m-75号阻，或7mllm;分?主角度走辈分越大，末校呈钝角分叉.叉校基音在路程并向末端交尖，两叉校民短略有差异，较伏的叫校常弯曲，给4枚较豆，末校长7m14m;量囊在末使顶端同步形成.易脱落李元色或淡黄色，狞襟彩或f形，无乳头状突起.大小为07m28严m)x (13m 17m)ol包囊鼓薄、j事I!均匀。熔稽毒病菌的于缸子与藏卵苦苦楚分离。成熟卵于包子呈桔黄至红褐色，球形，直径为20m-60m.外胞接常有瘤状饰纹。8结果判定从
10、烟叶上发现的精密病潮的泡装模利于包囊或卵子包子，符合上述形态特征的可鉴定为烟霜霉病菌。)08 G/T 18086-2000 附录A(提示的附录)冰冻匀浆法检验卵抱子A1 原理悯宿每病菌的卵于包子产生于病叶的组织内.病叶经冰冻生J浆使大多数叶肉组织、气孔细胞及维管!束组织破碎.向卵包子仍完整，通过网筛过滤、离心匀浆液，口I收集较高浓度的卵泡子。A2 方法取庄径为1cm烟霜霉病病斑或可疑叶碟，称量，每O.1 g叶碟(约含叶碟15个20个)，加磷酸缓冲液(pH二7.0，pb日)2mL.用玻棒搅拌，在室温下静11:15 min，放入18 C冷冻室内速冻2h，取冰冻叶碟移入生1浆I斗.加(l2)mLpbs冲洗，匀浆4min-6 min，用孔径为60m的不锈钢网筛过滤，并不断冲洗筛l叫收集j液。以1000 r /min转速离心3min，!顷去上清液，加乳盼泊定容至1mL.每批样品至少检在10个破片，记录卵f包子的数量。:w灯
