1、ICS 13.300;11.100 A 80 GB 中华人民11: 和国国家标准化学品GB/T 21772-2008 哺乳动物骨髓染色体畸变试验方法Chemicals-Test method of mammalian bone narrow chromosome aberration 2008-05.12发布2008-09-01实施被码，lIi伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布G/T 21772-2008 目。吕本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.475(1997年)哺乳动物骨髓染色体畸变试验)(英文版)。本标准作了下列编辑性修改:
2、增加了范围部分;计量单位改成我国法定计量单位;删除了OECD的参考文献部分。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位:中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本标准参加起草单位:辽宁省职业病防治院、天津市检验检疫科学技术研究院。本标准主要起草人:吴维皑、曲波、侯扮霞、李雪飞、白羽、刘清君、张国庆、张园。I GB/T 21772-2008 OECD引言1.本试验用于检测和评价受试物诱发啃齿类动物骨髓染色体结构畸变作用。染色体结构畸变可有两种形式，即染色体型畸变和染色单体型畸变。多倍体增加可能表明受试物有导致染色体数目畸变的潜在作用。大多数化
3、学致突变物诱发的染色体畸变是染色单体型畸变，但染色体型突变也可发生。染色体突变及其相关事件是很多人类遗传性疾病的原因，并且有充分的证据表明，引起癌基因和肿瘤抑制基因改变的染色体畸变及其相关事件，与人类和试验动物的癌症发生有关。2.本试验常规使用啃齿类动物。骨髓是本试验的靶组织，因它富含血管，且有大量易于分离和处理的快速循环的细胞。其他种属和靶组织不是本方法的对象。3.染色体畸变试验特别适合评价那些需要考虑体内代谢、药物代谢动力学和DNA-修复过程等因素的致突变危害，尽管上述因素在不同动物种属、不同组织之间可能存在差异。体内试验对进一步研究体外试验中检出的致突变作用也是有用的。4.如果有证据表明
4、受试物或其活性代谢产物不能到达到靶组织，则不适合使用本试验。E 1 范围化学品哺乳动物骨髓染色体畸变试验方法GB/T 21772-2008 本标准规定了化学品哺乳动物骨髓染色体畸变试验方法的范围、术语和定义、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于化学品哺乳动物骨髓染色体畸变试验。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 染色单体型畸变chromatid-type aberration 表现为单个染色单体断裂或染色单体间断裂和重接的染色体结构损伤。2.2 染色体型畸变chromosome-type aberration 表现为两个染色单体在相同位点断裂或断裂和重接的染色体
5、结构损伤。2.3 内复制endoreduplication 在DNA复制的S期后，细胞核并不进入有丝分裂期，而开始另一个S期的过程。结果是染色体含4、8、16个染色单体。2.4 裂隙gap 小于染色单体宽度的不着色的损伤，并伴有染色单体极小的错位。2. 5 数目畸变numerical aberration 染色体数目改变，不同于所用动物染色体的正常数目。2.6 多f音体polyploidy 单倍体染色体()数目的倍数，但不包括二倍体(即切，4n等等)。2. 7 结构畸变structural aberration 通过JE微镜可观察到的发生在细胞分化中期的染色体结构改变，镜下可见如缺失、碎片、内
6、交换或互换。3 试验基本原则通过合适的染毒途径，给实验动物染毒受试物，并在染毒后适当的时间处死动物。在处死前，动物用细胞中期分裂相阻断剂(如秋水仙碱或秋水仙素)处理。然后取骨髓细胞进行染色体制备、染色，分析中期分裂吁细胞的染色体畸变。GB/T 21772一20084 试验方法4. 1 准备4. 1. 1 动物晶、系选择通常使用健康、初成年的大鼠、小鼠和中国仓鼠，但也可用其他合适的哺乳动物。在试验之初，动物体重变异应不超过同性别平均体重的士20%。4. 1. 2 饲养条件实验动物房的温度应该为220C士30C。除清洁动物房外，相对湿度可保持在30%70%范围，但最好是保持在50%60%。应人工照
7、明，12h明暗交替。喂饲常规实验室饲料，不限饮水。也可以根据需要选择饲料，如果以受试物掺入饲料的方式进行染毒，应保证饲料与受试物适当混合。动物可单独或同性别少量动物笼养。4.1.3 动物的准备将实验动物随机分配到对照组和染毒组，饲养笼也应随机安排，以使可能的饲养笼放置效应减小。动物应有唯一的鉴别标记，并至少适应试验条件5d。4. 1. 4 受试物准备固体受试物在染毒前应榕于或悬浮于合适的溶剂或赋形剂中，并在动物染毒前进行适当稀释。液体受试物可直接或在染毒前做适当稀释。应使用新鲜制备的受试物，除非有资料证明贮存是稳定的。4.2 试验条件4.2. 1 溶剂/赋形剂搭剂/赋形剂在所用剂量水平不应产生
8、毒效应，不应与受试物有发生化学反应的可能。如果用未充分了解的溶剂/赋形剂，应有其相容性的资料支持。首先考虑使用水性溶剂/赋形剂。4.2.2 对照4.2.2.1 每个试验的每个性别都应包括同时进行的阳性和阴性(溶剂/赋形剂)对照组。除染毒受试物之外，对照组动物应与染毒组动物以相同的方式进行操作。4.2.2.2 阳性对照组的染毒剂量应预期在体内可检测到超过本底值的染色体结构畸变。阳性对照物的浓度应合理设计，最好是阳性结果既明显又不能使阅片者立即发现其为阳性对照组的标本片。阳性对照物的染毒途径可不同于受试物染毒途径，并且仅在一个时间点采样。如可能，可考虑利用与受试物化学结构相关的阳性对照物。阳性对照
9、物包括:三亚乙基密胶Ctriethy lenemelamine) CAS N o. 51-18-3 J 甲磺酸乙醋Cethyl methanesulphonate) CAS No. 62-50-0 J 乙基亚硝基腮Cethylnitrosourea) CAS No. 759-73-9J 丝裂霉素CCmitomycinC) CAS No. 50-07-7J 环磷酷股cyclophosphamideCmonohydrate)JCAS No. 50-18-0; CCAS No. 6055-19-2)J 4.2.2.3 每个采样时间点都应包括仅以洛剂/赋形剂处理的阴性对照组，并与染毒组同样的方式处置，
10、除非动物间的变异可以接受，并且有染色体畸变细胞频率的历史对照资料。如果对阴性对照组只做单次采样，则最适采样时间为首次采样时间。除非有历史性对照或文献资料证明所选用的溶剂/赋形剂元细胞毒性或无致突变作用，否则都应该有未做处理的空白对照。4.3 操作方法4.3. 1 动物数量和性别每个染毒组和对照组至少有10只可供分析用的动物，雌雄各半。如果研究时已有资料证明同一品、系的两种性别动物经相同途径染毒结果无显著差别，则可只用种性别动物。当人类暴露于该化学品可能有性别差异时(如某些药物)，则应选择相应性别的动物进行试验。2 GB/T 21772-2008 4.3.2 染毒程序4.3.2.1 最好采用一次
11、性染毒。若给予较大容量的受试物，也可分次染毒，即在一天内染毒2次，其间隔时间不扭过几小时。若采用其他的染毒方式应提供科学的理由。4.3.2.2 染毒后，应分别在两个不同的时间采集样品。啃齿类动物第一次采样时间一般在一个半正常细胞周期，即于染毒后12h18 h采集样品。由于受试物吸收、代谢需要时间以及对细胞周期动力学的作用，都可能影响染色体畸变检测的最佳时间。第二次采样时间推荐在第一次采样后24h。如染毒程序超过一天，应在末次染毒后一个半细胞周期时采样。4.3.2.3 动物在处死前，腹腔注射适量的细胞中期分裂相阻断剂(如秋水仙素)。然后间隔适当时间取样。小鼠约间隔3h5 h;中国仓鼠约间隔4h5
12、 h。从骨髓中采集细胞并分析染色体畸变。4.3.3 剂量水平如果因没有可供利用的合适资料，而需要进行预试验来确定剂量范围时，应采用与正式试验相同的实验室、相同品、系和性别的实验动物及染毒程序。如果存在毒性，对第一次采样时间应设计3个剂量水平。剂量范围的设计应覆盖从最大毒性至几乎元毒性。在之后的采样时间，仅需采用最高剂量。最高剂量是指产生毒性体征的剂量，并且根据同样的染毒程序，比其更高的剂量将引起动物死亡。对于低毒或无毒剂量时仍具有特殊生物学活性的物质(如激素和促细胞分裂剂等)可能是例外，应逐例评价。最高剂量也可定义为引起骨髓某些毒性指征的剂量(如有丝分裂指数降低50%以上)。4.3.4 限量试
13、验如果次性染毒或同一天内两次染毒剂量水平大于或等于2000 mg/kg，未产生可观察到的毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料推断受试物无遗传毒性，则不需要进行3个剂量水平的完整试验。对于1挺毒时间长达14d的较长期试验，剂量限度为每天2000 mg/kg;染毒时间超过14d，剂量限度为每天1000 mg/kgo根据人预期的暴露水平，有时可能需要采用更高剂量水平的限量试验。4.3.5 染毒通常采用经口灌胃或腹腔注射途径染毒。如果有理由，其他染毒途径也可接受。一次灌胃或注射染毒的最大液体容积取决于实验动物的大小，应不超过2mL/100 g。采用更大容积，必须说明理由。除了通常在较高浓度时可显示毒
14、效应增强的剌激性或腐蚀性物质外，应调整浓度确保在所有的剂量水平等容积染毒，以尽量减少因染毒容积不同所致的差异。4.3.6 染色体制备处死动物后迅速取出骨髓，经低渗和固定处理，然后将细胞分散到玻片上并染色。4.3.7 染色体分析4.3.7.1 对各染毒剂量组(包括阳性对照组)和阴性对照组，每个动物至少分析1000个细胞，测定有丝分裂指数，以确定细胞毒性。4.3.7.2 每个动物应至少分析100个中期分裂相细胞，如所见畸变率很高，观察的细胞数可减少。所有的标本片包括阳性对照和阴性对照，在镜检前应独立编号。由于制片方法常导致一定比例中期分裂相细胞的随裂而丢失染色体，因此所计数细胞含着丝点的数目应等于
15、2n士2。5 试验数据和报告5. 1 数据处理以动物为试验单位。用表格列出每只实验动物的资料。应对每只动物所计数的细胞数、每个细胞的畸变数均有染色体结构畸变的细胞所占百分率做出评价。染毒组和对照组不同类型染色体结构畸变的数目和视率也应列出。裂隙应单独记录和报告，但一般不计人总畸变率中。若没有证据表明性别间有明显差异，雌雄动物的数据可合并统计分析。5. 2 结果的评价5.2. 1 判断阳性结果的标准为:有染色体结构畸变的细胞数的增高呈现剂量-反应关系，或在某一采样GB/T 21772-2008 时间的某一剂量组有染色体结构畸变的细胞数明显增高。应首先考虑结果的生物学意义。统计学方法可用于帮助评价
16、试验结果，但统计学的显著性不应是确定阳性结果的唯一因素。对于可疑的试验结果最好应通过改进试验条件等，用进一步试验加以澄清。5.2.2 多倍体的增加，提示受试物具有潜在诱发染色体数目畸变的作用。内复制的增加表明受试物具有潜在的抑制细胞周期进展的作用。5.2.3 结果不符合上述判断标准的受试物，可认为在本试验系统中元诱发突变作用。5.2.4 虽然大多数试验可得到明确的阳性或阴性结果，但在少数情况下，所得到的资料并不能对受试物的致突变性作明确的判断。虽经多次重复实验，但结果仍可能是不确切或可疑的。5.2.5 体内染色体畸变试验的阳性结果，表明受试物具有诱发该种动物骨髓细胞染色体畸变作用;阴性结果表明
17、在本试验条件下，受试物不具有诱发该种动物骨髓细胞染色体畸变作用。5.2.6 应对受试物或其代谢产物到达体循环或靶器官而产生系统毒性的可能性进行讨论。5.3 试验报告试验报告应包括下列内容:5.3.1 受试物a) 名称和识别码如CAS编号(如己知); b) 物理性状和纯度;c) 与本试验相关的理化特性zd) 稳定性(如已知)。5.3.2 溶剂/赋形剂a) 选择依据;b) 受试物在洛剂/赋形剂中的溶解性和稳定性(如己知)。5.3.3 试验动物a) 所用品系;b) 动物的数量、年龄和性别;c) 来源、饲养条件、饲料等;d) 试验开始时动物的个体体重，每组动物的体重范围、均数和标准差。5.3.4 试验
18、条件4 a) 阳性对照和阴性(溶剂/赋形剂)对照;b) 剂量设计的预试验资料(如进行); c) 剂量水平选择的理由;d) 受试物制备的详细资料;e) 染毒的详细资料;f) 染毒途径的选择理由;g) 证明受试物到达体循环或靶器官的方法(如进行); h) 从饲料/饮水中的受试物浓度换算成实际染毒剂量mg/(kg.d)J(如进行hi) 饲料及饮水质量的详细资料;j) 染毒和采样时间的详细资料;k) 测定毒性的方法;1) 中期分裂相阻断剂的特性、浓度及处理时限;m) 标本制备方法;口)计数畸变的标准;0) 每只动物分析的细胞数;p) 判断试验结果为阳性、阴性或可疑的标准。5.3.5结果a) 毒性体征;
19、b) 有丝分裂指数;c) 每只动物的畸变类型和数量;d) 去j组的畸变总数、均数和标准差;) 染色体倍数的改变(女日观察到); f) 剂量;反应关系(如可能); g) 统计学分析;h) 同时进行的阴性对照资料;i) 历史上的阴性对照资料，包括范围、均数和标准差;j) 同时进行的阳性对照资料。5.3.6 结果的讨论5. 3. 7 结论飞G/T 21772-2008 5 CON-NhhFNH阁。华人民共和国家标准化学晶哺乳动物骨髓染色体睛变试验方法GB/T 21772一2008国中 美中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争导印张O.75 字数11千字2008年7月第一次印刷开本880X12301/16 2008年7月第一版9号书号:155066 1-32185 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 21772-2008
