1、ICS 13300；1302040A 80 国中华人民共$-n国国家标准GBT 2 1 803-2008化学品 快速生物降解性DOC消减试验200805-12发布Chemicals-Ready biodegradability-DoC die-away test2008-09-0 1实施丰瞀鳃紫瓣警矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会促19前 言GBT 21803-2008本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No301A(1992年)DOC消减试验(英文版)。本标准做了下列编辑性修改：将计量单位改为我国法定计量单位。本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。本标准由全国危
2、险化学品管理标准化技术委员会(sAcTc 251)提出并归口。本标准负责起草单位：环境保护部化学品登记中心。本标准参加起草单位：环境保护部南京环境科学研究所、上海市检测中心、上海市环境科学研究院。本标准主要起草人：孙锦业、刘纯新、胡征、刘济宁、单正军、陈晓倩、沈根祥。化学品快速生物降解性DOC消减试验GBT 21803-20081范围本标准规定了化学品快速生物降解性DOC消减试验的方法概述、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本标准适用于测试非挥发、水中溶解度不低于100 mgL的化学品的快速生物降解性。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2I快速生物降解性ready bi
3、odegradability受试物在限定时间内与接种物接触表现出的生物降解能力。22初级生物降解primary biodegradation受试物在生物作用下化学结构发生变化致使特性丧失的过程。23溶解性有机碳dissolved organic carbon，DOC溶液中有机碳的含量，常指通过045 pm滤膜过滤后液体中的有机碳含量，或经4 000 rrain转速离心15 min后上清液中的有机碳含量。24停滞期lag phase试验开始到降解率达到10的时期。25十天观察期10-d window生物降解率达到10之后的10 d试验时间。26降解期degradation phase停滞期结束到
4、降解率达到最大降解率的90的时期。3受试物信息a)分子式和结构式；b)水中溶解度c)蒸气压；d)碳含量；e)纯度；f)主要成分组成比例；g)吸附性；h)微生物毒性。1GBT 21803-20084方法概述41原理在一定体积已接种的无机培养基中，以受试物(10 mgL40 mgL，以DOC计)作为唯一的有机碳源，在温度为22土2、黑暗或散射光条件下曝气培养。28 d培养期间，以固定时间间隔测定DOC，用DOC去除浓度计算受试物快速生物降解率。另外，通过化学分析测定试验开始和结束时受试物浓度，可以确定受试物的初级生物降解性。42参比物本标准推荐苯胺(新蒸馏)、醋酸钠或苯甲酸钠作为参比物。若使用其他
5、参比物，试验报告中应加以说明。5试验准备51设备试验中应配备下列设备：a) 圆锥形烧瓶(250 mL2 L)；b)振荡器(士2)；c)微孔滤膜过滤器；d)DOC分析仪；e)溶解氧测定仪；f)离心机。52接种物521接种物选择接种物可以来自活性污泥、污水处理厂出水、地表水和土壤，或以上几种的混合物。522活性污泥接种物活性污泥采自污水处理厂或主要处理生活污水的中试规模的处理装置曝气池中的新鲜污泥样品，并保持有氧状态。在通过细过滤网去除粗糙的颗粒后，沉淀或离心分离(如：1 100 g，离心10 rain)将浮在表面上的杂质除去。污泥可用试验培养基进行清洗，使活性污泥在试验培养基中质量浓度为3 gL
6、5 gL，保持有氧培养直至使用。当污泥中可能含有抑制剂时，应清洗。将污泥与试验培养基充分混合后沉淀或离心分离后再悬浮，去掉悬浮物，再用试验培养基悬浮洗过的污泥。重复这一操作直到污泥中认为不含酶和抑制剂。试验前从悬浮污泥中抽取一份样品，确定活性污泥的干重。也可用匀浆器以中等速度将活性污泥搅拌2 min，使其均质化(3 gU5 gL)，沉淀30 rain或更长(如有需要)。与试验培养基按大约i0 mLL的比例，轻轻倒出液体作为接种物。523其他来源的接种物接种物也可采自污水处理厂或主要处理生活污水的中试装置的二级出水。采集一个新鲜样品并在运输中保持有氧状态。样品沉淀1 h或用粗滤纸过滤后，保持上清
7、液或滤出液在有氧状态直至使用。每升培养基可添加100 mL该接种物。接种物的另一个来源是地表水。收集一份地表水样品，如河水、湖水并保持有氧状态直至使用。如有必要，可通过过滤或离心将接种物浓缩。524接种物预处理如有需要，接种物可在试验条件下预处理，但不是对受试物的预驯化。预处理包括在试验培养基(不添加受试物)中对活性污泥或在试验温度下对二级出水曝气培养5 d7 d。2GBT 21803-200853试验用水为避免较高空白值，应使用去除毒性物质(如Cu2)的高纯度去离子水或蒸馏水，确保有机碳含量小于或等于受试物浓度的10，对于每组系列试验使用同一批水。54培养基541培养基贮备液用分析纯试剂制备
8、下列贮备液：a)磷酸缓冲液：称取850 g磷酸二氢钾(KH。PO。)、2175 g磷酸氢二钾(K2HPO；)、3340 g二水合磷酸氢二钠(NazHPOt2H20)和05 g氯化铵(NHtcl)，用水溶解，定容至1 L，pH值为74。b)氯化钙溶液：称取2750 g无水氯化钙(CaCI。)或3640 g二水合氯化钙(CaClz2Hz0)，用水溶解，定容至1 L。c)硫酸镁溶液：称取2250 g七水合硫酸镁(MgSOt7HzO)，用水溶解，定容至1 L。d)氯化铁溶液：称取025 g六水合氯化铁(FeCI。6H：O)，用水溶解，定容至1 L。加入005 mL浓盐酸或04 gL EDTA二钠盐缓冲
9、溶液保存。上述贮备液中如果出现沉淀，则需重新配制。542试验培养基的制备取541中磷酸缓冲液10 mL加入800 mL试验用水，再加氯化钙溶液、硫酸镁溶液和氯化铁溶液各1 mL，定容至1 L。6试验程序61组别设计a) 通常，试验中需要设置下列组别：含受试物和接种物的试验组(两个烧瓶平行)；仅含接种物的接种物空白对照组(两个烧瓶平行)；含参比物和接种物的程序对照组。b)必要时：含受试物和消毒剂的无菌对照组；含受试物、接种物和消毒剂的吸附对照组；含受试物、参比物和接种物的毒性对照组(见附录A)。62受试物贮备液受试物或参比物的水中溶解度若超过1 gL，则称取1 g10 g，用试验用水溶解并定容至
10、1 L。否则，将受试物直接加入试验培养基中，确保受试物溶液均质化。63试验操作以2 L烧瓶装1 L悬浮液为例，烧瓶中先装入800 mL试验培养基，再加入受试物贮备液，使烧瓶中DOC的质量浓度为10 mgL40 mgL，调节pH值至74，烧瓶中接种物质量浓度不大于30 mgL，用试验培养基定容至1 L，混合后用铝箔将烧瓶口盖住，并确保烧瓶中试验药液和外界空气能自由交换，将烧瓶置人振荡器中培养。同样用试验培养基配制空白对照组，只加接种物，不加受试物。混合之后，从每个烧瓶取样测定其初始DOC浓度。用试验培养基接种一瓶同时含有受试物和参比物的溶液，检查受试物对接种物的抑制影响。用经灭菌的未接种的受试物
11、溶液检查受试物是否发生非生物降解。可采用滤膜(o2xm045 pm)过滤或加入适当的有毒物质来灭菌。另外，可采用一个含有受试物、接种物和消毒剂的吸附对照组烧瓶检验受试物在污泥、容器壁上的吸附性，评价受试物的吸附程度。3GBT 21803-200828 d培养期间，间隔一定时间取样，取样前加适量水补充试验中蒸发掉的水分，并将培养基充分混合确保在取样时粘附在容器壁上的受试物再次溶解或悬浮。取样次数应保证可以评价十天观察期降解率，取样后用滤膜过滤或离心分离(见附录B)，如能当天分析试验药液浓度，则可依据测定结果确定下次取样时间；否则，样品可在24下保存48 h或在一18长期保存，分析测定时可先分析最
12、后取的样品，用逐步倒退法选择分析其他样品，以相对较少的分析次数获得较好的生物降解曲线。若第28天样品显示没有发生降解，则其他样品无需分析。7质量保证与质量控制a) 在稳定期、试验结束时或十天观察期结束时，平行试验间的降解率最大差别应低于20。b)试验进行到14 d时，参比物程序对照的降解率(以DOC计)不低于70。8数据与报告81 结果处理对于含受试物和接种物的试验悬浮液处理，用DOC测定平均值计算每次取样时两个试验组烧瓶的降解率(D。)。见式(1)：式中：D。#时刻的降解百分率，；c。含受试物和接种物的试验组的初始DOC平均质量浓度，单位为毫克每升(mgL)；ct含受试物和接种物的试验组t时
13、刻的DOC平均质量浓度，单位为毫克每升(ragL)；csm， 空白对照组的初始DOC平均质量浓度，单位为毫克每升(ragL)；ctm，f时刻空白对照组的DOC平均质量浓度，单位为毫克每升(mgL)。所有浓度值为试验中测得。用含有受试物的两个烧瓶的平均值，绘图表示降解过程，如果试验符合有效性标准，指出十天观察期。计算和报告在稳定期、试验结束和在十天观察期结束时的去除百分率。当有无菌对照时，用式(2)计算非生物降解百分率：式中：Dn非生物降解百分率，；。，无菌对照组的初始DOC质量浓度，单位为毫克每升(mgL)；c。，f时刻无菌对照组的DOC质量浓度，单位为毫克每升(ragL)。82结果报告试验报
14、告应包括以下内容：a)受试物：物理属性，及基本理化性质；受试物鉴别数据。b)试验条件：接种物：状态和取样地点，浓度和预处理方式；污水中工业废水的比例和状况(若已知)；试验周期与温度；如果受试物是非常难溶的物质，提供受试物溶液悬浮液制备方法4GBT 2 1 803-2008程序改变的原因及解释说明。c)结果：将数据填入“数据表”(见附录C)；任何观察到的抑制现象；任何观察到的非生物降解；化学物质分析数据(如果有)；受试物降解产物的分析数据(如果有)；受试物及参比物的降解曲线，包括停滞期、降解期和十天观察期和斜率稳定期、试验结束时和(或)十天观察期结束时的降解百分率。d)结果讨论。GBT 2 1
15、803-2008附录A(资料性附录)受试物对接种物生长抑制作用的处理当快速生物降解试验中受试物表现为无生物降解性时，为判别是源于受试物对接种物的抑制作用还是因为受试物的惰性，推荐采用以下措施：微生物毒性试验和生物降解试验采用类似或相同的接种物；微生物毒性试验可以单独或联合采用以下方法：活性污泥呼吸抑制试验、BOD和(或)微生物生长抑制试验；生物降解性试验中，为避免受试物抑制接种物的活性，建议受试物浓度设置为Ecs。的110(或低于EC。)。若受试物对接种物Ec5。大于300 mgL时，可判定受试物对接种物无抑制影响；当受试物对接种物EC；。低于20 mgL时，应设置较低的受试物浓度。推荐采用密
16、闭瓶法试验或使用“C标记材料评价生物降解性；若采用经受试物驯化的接种物，试验时可设置较高的受试物浓度，但试验结果不能用于评价快速生物降解性。B1 溶解性有机碳(DOC)附录B(资料性附录)有关参数的计算和确定GBT 21803-2008根据定义，溶解性有机碳是指任何化合物或混合物中溶于水并能通过045Lm滤膜的有机碳。从试验容器中取出样品后立即用适当的过滤器和滤膜过滤，舍去最初的滤出液20 mL(当使用小过滤器时，此量可相应减少)，保留10 mL20 mL(取决于分析需要的体积)供有机碳分析，用有机碳分析仪测定DOC浓度，有机碳分析仪必须能够精确测量相当于或低于在试验所用的起始DOC浓度的10
17、的量。在同一工作II内不能测定滤液样品时，可在冰箱中4下保存样品，但保存时间不得超过48 h，在一18可保存较长时间。注：滤膜表面通常涂有亲水性涂层物质，这样，过滤器就可能含有溶解性有机碳，影响生物降解性的测定。将过滤器放人去离子水中煮沸3次、每次1 h，可去除涂层物质和溶解性有机物，其后过滤器可在去离子水中保存一星期。如果使用一次性的过滤器，则每批都应检查确保其不释放出溶解性有机碳。同时确保受试物不被过滤器吸附。在离心力4 000 g(约为40 000ms2)下离心15min可代替过滤，由于不是全部的细菌都能去除，或者细菌体的部分有机碳会再溶解，该方法不适用于分析DOC初始浓度低于i0 mg
18、L的样品。7GBT 21803-2008C1实验室C2试验开始日期c3受试物附录c(资料性附录)DOC消减试验数据表名称：受试物贮备液浓度：mgL(以化学物质的质量计)试验培养基的初始浓度，to：mgL(以化学物质的质量计)C4接种物来源：处理方式：预处理，如有：在反应混合物中悬浮固体浓度：mgLC5碳测定结果见表C1。表C1 DOC测定结果n夭以后的DOC浓度(mgL)瓶号01含受试物和 平均值“m接种物的试验组 b12 b2平均值，3平均值o“)d1仅含接种物的 4 也空白对照组 平均值白m平均值一一塑!孛一c6原始数据的评价见表C2。表C2降解率测定结果GBT 21803-2008n天以
19、后的降解瓶号 计算结果0l D。一1)1。X100 0L Ca(O)一Cbl(O)12 D2一1r100 0L “(o)6bl(O)J平均值 n一D,T+D2 0注：参比物和毒性对照试验可以使用相似的格式。a D，和D：如果有相当大的差异，则不应取其平均值。c7非生物降解(可选)非生物降解测定结果见表C3，非生物降解率按式(c1)计算。表C3非生物降解测定结果时间dO Tl不含接种物的无菌对照组的DOC浓度(mgL)C8化学物质分析(可选)受试物残留量测定结果见表C4。眈一鱼!L塑X100表C4受试物残留量测定结果试验结束时受试物的残留量 初级降解不含接种物的无菌对照组 &含接种物的试验组 Sd 墨尊100
