1、ICS 13.300;13.020.40 A 80 ，在.飞.飞. :.町、.飞去.L. 民豆豆温邸，黑黑黑.诅E.，:， . -.,._ m，:_屯，:、z-.、J. . .,: . : . .:. . : . 飞;:.，一一一一-中华人民共和国国家标准GB/T 21809-2008 化学晶蜓蚓急性毒性试验Chemicals-Test method of earthworm acute toxicity test 2008-05-12发布2008-09-01实施做踊防伪中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 21809-2008 前言本标准等同采用经济合作
2、与发展组织(OECD)化学品测试导则No.207(1984年)(蜓蚓急性毒性试验。本标准附录A为资料性附录。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准负责起草单位z中国检验检疫科学研究院。本标准参加起草单位:辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人z于文莲、陈会明、王军兵、周新、郝楠、刘海波、周川、刘卫东、孙鑫、王睁。I GB/T 21809-2008 化学晶蜓蚓急性毒性试验1 范围本标准规定了化学品蜓蚓急性毒性试验的受试物信息、方法概述、仪器设备、试验方法、数据与报告。本标准适用于评价化学品的蜓蚓急性毒性。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.
3、1 半鼓致死浓度LCso 在测试期间使50%供试生物死亡的受试物浓度。在试纸接触试验中，受试物以mg/cm2来表示;在人工土壤试验中以mg/kg(干重)表示。3 受试物信息a) 水中榕解度;b) 蒸气压;c) 结构式zd) 纯度;e) 在水、土壤和光中的稳定性50 正辛醇/水的分配系数(Pow); g) 快速生物降解试验结果。4 方法概述4. 1 简介本方法适用于榕于水和不榕于水的物质，但是测试方法不同。测试化学品对蜓蚓的毒性有许多方法，包括点施，强制饲喂和全浸试验。本方法包括二个试验方法z滤纸接触毒性试验和人工土壤试验。简单的滤纸接触毒性试验作为预试验，可得出土壤中受试物对蜓蚓的可能毒性，决
4、定是否需要进行进一步的人工土壤试验。接触试验简单，易于操作，使用推荐生物的试验结果具有可重复性。人工土壤试验得出的毒性数据能代表蜓蚓在化学品自然暴露下的情况。对照组的死亡率在试验结束时不能超过10%，试验是有效的。4.2 参比物为测定LCso应选定一个参考物质，以确保试验室测试条件是足够的且没有显著改变。氯乙酷股( Chloracetamide)是合适的参照物。4.3 试验原理预试验(滤纸接触毒性试验)将蜓蚓与湿润纸上的受试物接触，识别出对土壤中蜓蚓的潜在毒性化1 F GB/T 21809-2008 学品。人工土壤试验系将蜓蚓置于含不同浓度受试物的人工配制土壤中，7d和14d后，评价其死亡率。
5、其中应包括使生物无死亡发生和全部死亡的两个浓度组。4.4 试验有效性对照组的死亡率在试验结束时不能超过10%，试验是有效的。5 仪器设备5. 1 试验室常规仪器设备和特殊设备z一一蜓蚓养殖(见附录A);一一滤纸:80g/m2 -85 g/m2，厚度0.2mm左右，中级;人工土壤试验基质。泥炭薛灰10%(pH值尽可能接近5.5-6.0，元明显植物残体，磨细，风干，测定含水量); 高岭蒙古士20%(高岭石质量分数大于30%);石英砂70%(50m-200m粒径的细砂质量分数在50%以上); 加入碳酸钙调pH值为6.0土0.5(见参考文献6J);以正确比例混合人工土壤的各个干燥组分。为了混合均匀，可
6、采用大型试验室搅拌器或小型水泥电动搅拌机。然后取少量上述样品置于105C条件下烘干称重，测定其含水量。加人去离子水使其含水量达到干重的35%左右，混合均匀。混合物不能过湿，当挤压人造土壤时不能有水分出现。一一玻璃容器z结晶皿，或加有盖玻璃或具孔塑料板的1L烧杯。一一培养装置z光照度400lx-800 lx，温度控制土2C的培养箱。5.2 试验生物推荐的蜒蚓品种是赤子爱胜蚓Eiseniafoefida( Michaelsen)，虽然这种距蚓不是典型的土壤品种，但它存在于富含有机质的土壤中，对化学物质的敏感性与真正栖息在土壤中的魁蚓类似，其生命周期短，在20C的条件下，孵化需要3-4周，7-8周即
7、可发育成熟。它繁殖能力强，一条蜓蚓可以在一周内产2-5个蚓茧，每个蚓茧可孵出几条蜓蚓。它易于在含各种有机废物的土壤中饲养，蚓茧容易购得或从一个来源分发，这有利于确保采用同一品系(见附录A)。赤子爱胜蚓存在两个分支，有些分类学家将其分开(见参考文献lJ)，其形态很相象，但E.foetida foetida的环节上有一典型的横纹或环带，而E.foetida andrei则没有，但带有斑驳的红色。如果可能宜采用E.foetida foetida D当必须使用某种方法时，也可以使用其他品种。选择二月龄以上，体重300mg-600 mg的健康蜓蚓供试验用。6 试验方法6. 1 谑纸试验采用长8cm，直径
8、3cm的平底玻璃管。内壁衬铺滤纸，滤纸的大小以不重叠为宜。受试物溶于水(溶解度大于1000mg/L)或适宜的有机溶剂(如丙酣、正己皖、氯仿)，在已知浓度范围内配成浓度系列溶液。用移液管向每个玻璃管移入1mL受试物溶液，用过滤的压缩空气吹干，气体流速不要太快。在干燥过程中，水平旋转玻璃管(对不易溶解于水或有机溶剂中的物质必须重复几次上述过程)，以获得试验所需的受试物在滤纸上的沉积量。对照组用1mL的去离子水或有机溶剂处理。干燥后在每一玻璃管内加1mL去离子水以湿润滤纸，用留一小孔的塞子或塑料薄膜封住玻璃管口。GB/T 21809-2008 在正式试验之前，应预先进行选择浓度范围的试验，浓度设计见
9、表1.表1滤纸接触法预试验浓度设计受试物在滤纸的沉积量/受试物浓度/(mg/cm) (g/mL) 1. 0 7 X 10- 0.1 7X10 0.01 7X 10-4 0.001 7X10-5 0.000 1 7 X 10-6 正式出验应设置5个以上按几何级数增加的试验浓度组。每试验浓度应至少设10个以上重复，每个玻璃瓶只能放置1条蜒蚓，因为同一管内蜓蚓的死亡可能对其他蜒蚓造成有害影响。精密度试验应进行20个重复，每一个试验浓度水平范围应使用10个控制管。为了使蜓蚓排出肠内的内含物，在试验开始前，先将蜓蚓置于湿润的滤纸上3h，然后冲洗，用滤纸吸干，供试验用。将玻璃管并排置于盘内，温度控制在20
10、C土20C，试验在黑暗条件下进行48h，亦可延长至72h，观测记录蜓蚓死亡情况。判别蜓蚓死亡的标准是当蜓蚓前尾部对轻微机械剌激没有反应即以死亡计，同时观察报告蜓蚓的病理症状和行为。6.2 人工土壤试验在正式试验之前，一般需预先进行选择浓度范围的试验，按几何级数设置5种不同浓度组，如0.01 mg/kg、O.1 mg/kg, 1 mg/kg、10mg/kg, 100 mg/kg和1000 mg/kg (人工土壤、干重)。6.2. 1 试验介质处理在试验开始前，将受试物溶于去离子水，然后与人工土壤相混合或者用精细的层析喷头或类似的喷头喷到土壤中。倘若受试物不榕于水，可使用尽可能少量的有机潜剂(如正
11、己皖、丙酣、氯仿等)，溶剂必须是可挥发性的。若受试物既不可溶，也不可分散或乳化，可将一定量的受试物与石英砂棍舍，其总量为10g，然后在试验容器内与740g湿的人工土壤混合，总量为750g。当只能采用易挥发性有机溶剂溶解、分散和乳化受试物时，在试验开始之前，应将榕剂全部挥发，应补充蒸发的水量。对照组须接受任何同样向量的处理。6.2.2 试验步骤对于每一试验，在玻璃容器中加入750g湿重的试验介质和10条蜓蚓。这些魁蚓在试验前已在人工土壤环境中饲养24h，在使用之前将蜓蚓冲洗干净，放在试验介质表面。用具孔的塑料板盖好容器以防试验介质变干。每一处理组和对照组应有4个平行样。每一试验应用各有10条蜓蚓
12、的4个结晶皿，进行相同的溶剂对照试验。整个试验期为14d，在20C土2C，湿度80%的条件下培养，并提供连续光照(以保证试验期间蜓蚓始终生活在试验介质中)。试验在第7天和第14天评估蜓蚓死亡率，应记录观察到的异常行为或病理症状。第7天将培养瓶内的试验介质轻倒入一玻璃皿或平板，取出蜓蚓，检验蜓蚓前尾部对机械剌激的反应，检查结束后，将试验介质和蜓蚓重新置于培养瓶中继续培养。14d时再进行相同的检查。3 GB/T 21809-2008 试验结束时，应分析和报告试验介质的含水率。7 数据与报告7. 1 数据处理将死亡率和受试物浓度数据应在对数-概率纸上作图，计算LCso和置信限(见参考文献3J)，也可
13、使用其他概率计算的方法。当两个连续浓度的死亡率为0和100%.并呈几何级数(比率最大为2.0).这两个水平可充分指出LCso范围。7.2 试验报告试验报告应包括:7.2. 1 受试物z化学特性、施用方法。7.2.2 供试生物2年龄、饲养和繁殖条件、来源。7.2.3 试验条件E详尽描述所有试验材料和试验条件以及任何改变。7.2.4 试验介质的准备情况。7.2.5 结果:4 一每一处理在试验开始和结束时，存活蜓蚓的平均体重和数量p一一一在试验过程中蜓蚓的详细生理和病理症状或异常行为记录;一一测定LCso的方法，数据和结果E一一-浓度-效应曲线图z一一对照组的死亡率z一一参照物和受试物的死亡率;一-
14、LCso及所有用于计算的数据;一一人工土壤在试验开始和结束时的湿度，以及开始时的pH值;一一死亡率为0的最高浓度z一一一死亡为100%的最低浓度。附录A(资料性附录)试验动物的饲养G/T 21809-2008 Eisenia foetida可在许多动物废弃物中繁殖。推荐的繁殖介质为马粪或牛粪与泥炭以50: 50混合，其他动物废弃物也适用;介质的pH值为7左右、低离子电导率(低于6.0mS)和不能受到氨或动物尿的过度污染。木制饲养箱规格为50cmX 50 cmX 15 cm，上面用合适的盖子盖紧。在6周的时间内可繁殖1000 条蜓蚓。为生产足够的蜓蚓，介质能在20峙的废物中养殖高达1kg的蜓蚓，
15、以及每一个蜓蚓将重达1 g。为获得蜓蚓标准的年龄和体重，最好是在20C开始培养蚓茧，3周4周孵化，7周8周成为成熟的蜓蚓.5 GB/T 21809-2008 参考文献lJ M. B. Bouch岳，Lombriciensde France , Ecologie et Systmatique. Publ. Institut National de la Recherche Agronomique(1972). 2J C. A. Edwards and J. R. Lofty, Biology of Earthworms , 2nd Edition, Chapman and Hall, Lon d
16、on(1977). 3J J. T. Litchfield and F. Wilcoxon ,ournal of Pharmacol. Exper. T her. 96. 99113(1949). 4J C. E. Stephan,in Aquatic T oxicology and Hazard Evaluation (edited by F. L. Mayer and J. L. Hamelink)pp. 66-84 ,ASTM STP 634 ,American Society for Testing and Materials(1977). 5J C. A. Edwards ,Deve
17、lopment of a Standardized L aboratory Method for Assessing the Toxicity of Chemical S ubstances to Earthworms , Report EUR 8714EN, Commission of the European Communities(1983) . 6J The Analysis of Agricultural Materials ,Ministry of Agriculture,Fisheries and Food,Reference Book 427 , HMSO,London(1981). 6 OON|gFNH阁。华人民共和国家标准化学晶魁蚓急性毒性试验GB/T 21809-2008 国中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数11千字却08年7月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2008年7月第一版* 书号:155066 1-32240 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 21809-2008
