1、ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /T 1097-2006 食用茵茵种真实性鉴定自旨酶同工酶电泳法Verification of genuineness for edible mushroom spawn-Esterase isozyme electrophoresis 061018000023 2006-07 -10发布2006 -10-01实施中华人民共和国农业部发布前言本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。NY /T 1097-2006 本标准起草单位:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、农业部微
2、生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心。本标准主要起草人:黄晨阳、张金霞、陈强、张瑞颖、郑素月、管桂萍、胡清秀、李俊。I NY/T 1097-2006 食用菌菌种真实性鉴定醋酶同工酶电泳法1 范围本标准规定了食用菌菌种真实性鉴定方法醋酶同工酶电泳法的原理、仪器、试剂、电泳操作、试验结果的观察和统计分析。本标准适用于糙皮侧耳(Pleurotusostreatus )、白黄侧耳(Pleurotus cornucoiae)、肺形侧耳(Pleurotusulmonarius)、佛州侧耳(p切rotustreatusvar. florida )、香菇(Lentinulaedodes )、杏鲍菇(Ple
3、urotus eryngii )、双抱蘑菇(Agaricusbisporus )、黑木耳(Auriculariaauricula )、茶树菇(Agrocybecylindrica ) 等食用菌菌种真实性的鉴定，包括母种(一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T 528 食用茵茵种生产技术规程3 术语和定义3.1 N
4、Y/T 528中确立的以及下列术语和定义适用于本标准。菌种真实性genuineness of spawn 供检菌种与对照菌种的符合性。4 原理在生物中，酶的表达受遗传基因的调控。醋酶是多等位基因调控的酶类，在凝胶电泳中经聚丙烯酷胶凝胶的浓缩，在分子筛效应和电场的电荷效应作用下而发生分离。从食用菌菌丝体中提取的粗酶液经电泳后，进行醋酶的生物化学染色，不同的醋酶组分显示在凝胶的不同位置而形成醋酶同工酶酶谱。相同的菌种遗传背景相同，其醋酶同工酶酶谱也相同。因此可以用醋酶同工酶酶谱对食用菌菌种的真实性进行鉴定。5 仪器5.1 电泳仪5.2 垂直摄电泳槽5.3 高速冷冻离心机(10000r/min以上)
5、5.4 冰箱5.5 离心管5.6 研钵(备有研样)5.7 分析天平(感量0.01g、0.0001g各一台)5.8 微量进样器1 NY /T 1097-2006 6 试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。6.1 样晶提取缓冲液(pH7 .5) 称取6.02g磷酸氢二铀(Na2HP04. 12H20) ,0.5 g磷酸二氢饷(NaH2P042H20)，溶于水中，并稀释至100mL。6.2 过硫酸锻溶液1. 4 glL。称取0.14g过硫酸镀，溶于水中，并稀释至100mL。用时现配。6.3 核黄素溶液0.04 glLo称取0.004g核黄素，溶于水中，并
6、稀释至100mL。用时现配。6.4 藤糖溶液400 glL。称取40g煎糖，溶于水中，并稀择至100mL。6.5 分离胶缓冲液(pH8.9)称取36.3g三起甲基氨基甲烧(C4HllN句，Tris)，用48mL 1molIL盐酸溶解，然后加N，N，N, N 甲基乙二胶(C;H16问，TEl在ED)0.23mL，用水定容至100mL，4C贮存。6.6 浓缩胶缓冲液(pH6.7) 5.98 g三程甲基氨基甲皖(C4HllN马，Tris)，用48mL 1molIL盐酸溶解，然后加N，N，町，N二甲基乙二股(C;H16陀，TEMED)0.46mL，用水定容至100mL，4C贮存。6.7 分离胶母渣称取
7、28.0g丙烯眈胶(C:JH5NO，Acr),0.735 g甲叉双丙烯眈胶(HlON2乌，Bis)，溶于水中，并稀释至100mL，用棕色瓶4C贮存。6.8 浓缩胶母渡称取1O.0g丙烯酷胶(C:JH5NO，Acr) ,2.5 g甲叉双丙烯酷股(HlON2乌，Bis)，溶于水中，并稀释至100 mL，用棕色瓶4C贮存。6.9 电极缓冲液称取6.0g三连甲基氨基甲炕(C4 Hll N:3 , Tris) ，甘氨酸(CzH5N乌)28.8g，溶于水中，并稀释至1 L，使用时稀释10倍。6.10 磷酸缓冲液(pH6.5) 称取2.26g磷酸氢二铀(Na2HP04. 12H20) ,2.14 g磷酸二氢
8、饷(NaH2P042H20)榕于水中，并稀释至100mL。6.11 染色液秸哝50mg乙酸-1-荼醋(C12HlOz ) , 50 mg乙酸-2-荼醋(C12HlOz ), 100 mg固兰RR盐(Ct5H14 CIN3:3 1I2ZnClz) ，用5mL丙酣溶解，再加入磷酸缓冲液(6.10)150mL，过滤。6.12 Z酸溶液70mLIL。量取14mL乙酸，加到适量水中，并稀释至200mLo 6.13 滇酣蓝指示液称取澳酣蓝0.1g，加0.05mollL氢氧化锅溶液3.0mL使之溶解，用水稀释至100mL。6.14 石英砂7 分析步骤7.1 试样制备2 NY/T 1097一20067.1.1
9、 菌丝体培养将被检菌种与对照菌种在相同条件下培养，培养量以各自可以做3个平行试验为准。培养基和培养条件见附录A。7.1.2 试样制备收集被检菌种与对照菌种的菌丝体各3份，样品研磨见附录B。将研磨后的样品在4C下10000r/min离心10min，取其上清液，将上清液、煎糖榕液(6.4)和澳酣蓝指示液(6.13)按5+1十1的比例混合，混合液即为电泳样品。7.2 凝胶制备7.2.1 分离胶根据食用菌种类配制分离胶，分离胶配制见附录C，然后将分离胶灌入胶室至距短玻璃板上沿2.5 cm3.0 cm，加入适量的水封住胶面，待凝胶聚合后将水吸出。7.2.2 浓缩胶将浓缩胶缓冲液(6.6)、浓缩胶母液(6
10、.8)、核黄素溶液(6.3)和廉糖溶液(6.4)按1+2+1+4比例混合，搅拌均匀，灌入胶室，立即插好样品梳，日光或灯光下聚合。7.2.3 点样浓缩胶聚合后，小心抽出样品梳，吸去点样孔中多余的水分，注入电极缓冲液(6.9)，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铀金丝;用微量进样器吸取适量样品加入样品孔中。点样时被检样品与标准样品间隔一个点样孔。7.2.4 电泳将电泳槽和电泳仪连接后，打开电源，采用稳流电泳，电流为1mA/cm2 mA/cm，待指示剂进入分离胶后，将电泳槽放入冰箱内进行低温电泳，并将电流升至2mA/cm3 mA/cm。待澳酣蓝指示剂下移至距胶底部约1cm时，停止
11、电泳。7.2.5 取胶染色倒出电极缓冲液，卸下胶条，在水中启开玻璃板，取出凝胶片，浸入染色液中，室温下染色15min 30min，用蒸馆水冲洗后置乙酸溶液(6.12)中固定。8 试验结果的观察和统计分析观察样品酶带的位置，计算每条酶带的迁移率(Rf)，Rf按下列公式计算:Rfn=? 式中:R儿一一条带n的迁移率;dn一一条带n的迁移距离，单位为厘米(cm);d一一澳酣蓝的迁移距离，单位为厘米(cm)。计算结果表示到小数点后两位。同时将凝胶片照相或用扫描仪扫描存图。根据对照菌种每条酶带在被检菌种中出现与否，计算被检菌种和对照菌种二者之间的相似系数。3 NY /T 1097-2006 A.l 培养
12、基配方附录A(规范性附录)菌丝培养条件A. 1. 1 马铃薯200g(用浸出汁)，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然。A. 1.2 Difco PDA培养基。A.2 培养条件直径75mrn或90mrn培养皿，24C:t 1 c避光培养;糙皮侧耳、白黄侧耳、肺形侧耳、佛州侧耳和茶树菇培养9d;杏鲍菇培养12d;黑木耳、香菇和双抱蘑菇培养15d。4 B.1 液氮研磨法附录B规范性附录)样晶研磨方法NY /T 1097-2006 称取菌丝体0.5g，加液氮研磨，将样品收集于1.5mL离心管中，加人1.0mL样品提取液(6.1)。B.2 冰浴研磨法称取菌丝体0.5g，加入1.0mL样品
13、提取液(6.1)和少量石英砂，冰浴研磨，将样品收集于1.5mL 离心管中。5 NY/T 1097一2006附录C(规范性附录)分离胶配制糙皮侧耳、白黄侧耳、肺形侧耳、佛州侧耳、茶树菇、杏鲍菇、黑木耳、香菇分离胶浓度7%，将分离胶缓冲液(6.5)、分离胶母液(6.7)、水和过硫酸镀溶液(6.2)按1+2+1+4比例混合，搅拌均匀，即可使用。双抱蘑菇分离胶浓度9%，将分离胶缓冲液(6.5)、分离胶母液(6.7)、水和过硫酸镀溶液(6.2)按2+5+1+8比例混合，搅拌均匀，即可使用。6 CON-hgF HMZ 中华人民共和国农业行业标准食用菌菌种真实性鉴定醋酶同工酶电泳法NY /T 1097-2006 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(由邮E政编码:10002却6网址:www.cca叩中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销争69号美印张0.75字数7千字2006年9月北京第1次印刷印数:1-500册定价:10.00元长争e* 开本880mmx1230mm 1116 2006年9月第1版书号:16109. 798 版权专有僵权必究举报电话:(010) 65005894
