1、人和国出检翰行准SN/3767.14-2014 出成分环介导等温扩增CLAMP)槛制方法第14部分:玉米59122晶小E主国Jl转基Loop-mediated isother血alampHfication detection method for genetically modified co脑ponentsin food for export-Part 14: Maize 59122 2014-01-13发布2014-08-01实施中华人民共和国发布国家藏量监督栓黯拴痊总局同给WNlcnf;v315c町、也话4问仅J6JB2315SN/3767.14-2014 F.l1J SN/T 3767
2、(出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP
3、356043品系;第18部分:大豆GTS40-3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻Bt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜丑7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第14部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专
4、利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:贺艳、陈其勇、刘伟、付伟、张裕君、郑文杰、陈颖、t彼珊、李志勇、常彦磊。I SN/T 3767.14-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第14部分:玉米59122品系1 范围SN/T 3767的本部分规定了检测方法。本部分适用于进出口玉米及本方法的定性检测低限为1.2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日
5、期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室用转基因产GB/T 19495.7 转基因产品SN/T 3767. 2-2014 出口选方法3 防污染撞撞环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样按照GB/T19495. 7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495. 3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理的环介导等温扩增CLAMP)初筛特异性的定性检测。件，仅注日期的版本适用于本文本文件。CLAMP)检测方法第2部分:筛根据转基因玉米59122品系外源基因和玉米边界序列(参见附录A)设计特异性内引物、外引物和SN/T 3767.14-2014 成环引物各一对，特
6、异性识别目标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在玉米品系59122特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎白环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2十结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加入预先提合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时锺离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被悴灭，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与锤离子结合，形成不可逆的沉淀物，将钮离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光
7、，同时体系中的镜离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧光，颜色也由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0 oC土0.5oC和80.0oC:!:O. 5 oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5 mL。6.2.4 移液器:量程O.5L10L;量程10L100L;章程100Ll000Lo 6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核背酸浓度10mmol
8、/Lo 6.3.3 Bst DNA聚合酶:酶浓度8U/f-tL，建议采用NEB的Bst酶，或者具有同等效力的酶。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl (pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氧化饵、20mmol/L硫酸镜、1%TritonX-100。6.3.5 硫酸镇榕液:50mmol/Lo 6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:钙黄绿素荧光染料，0.312mol/L。6.3.8 引物:根据转基因玉米59122品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、成环引
9、物1和成环引物2。外引物扩增片段长度为209bp，序列信息见附录A。夕卡引物1(F3，5-3):CGAACGATTCAGATGGCA 外引物2(B3，5-3):TTGCGGTTCTGTCAGTTC 内引物l(FIP，5人3): CCTTCACTCTTTCTTCCGTCCCTTCTCGT ACTCACCAACA TTG 内引物2(BIP ,5 -3 ) : TT AAACTG AAGGCGGG AAACG AG TCA T AACG TG ACTCCCTT AA 环引物l(FLP，5人3):TGAGCCAATCACAGGTGC 环引物2(BLP，5-3) :CAATCTGATCATGAGCGGA
10、GA 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:SN/T 3767.14-2014 采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板。6.4 .1.3 设两个空白对照:-一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767. 2-2014的规定进行。
11、6.4.3 59122品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表l。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液棍合进入反应液中。表1玉米59122品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2. 5 1 外寻|物l(F3)10mol/L o. 5 O. 2mol/L 外引物2(B3)10 f- mol/L O. 5 0.2 f- mol/L 内引物l(FIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L 内寻|物2(BIP)40mol/L
12、1. 0 1.6mol/L 环寻|物l(FLP)10 f- mol/L O. 1mol/L 环引物2(BLP) 10 f- mol/L 1 0.4 f- mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸续150 mmol/L l 6 mmol/L sl DNA聚合酶8 U/L 1 0.32 U/f- L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/L 水补足至25.06.4.4 LAMP反应参数63.0 oC:!:O. 5 oC恒温扩增90min , 80. 0 oC士0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5
13、 显色反应反应结束后，立即将显色液与反应液上下颠倒轻轻泪匀，在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果3 SN/3767.14-2014 出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该
14、样品转基因玉米59122品系初筛阳按照欧盟CRLV03/05一一一可对外引物PCR扩增8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 检测结果为转基因玉米594 附录A): 实验情况进行结果判断和表述。SN/T 3767.14-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米59122品系基因序列A.1 转基因玉米59122品系外源基因和玉米边界序列(PatentNo. US20060070139) 1 CGAACGATTC AGATGGCAAA ACTATGAATC TTTTTGTTTG AAGTCCCAAA 51 101 CATAAAAATT CTGG 151 AAAGCGCTCA 201 25
15、1 A.2 引物碱基序列及构成外引物l(F3，5 -3) : CGAACG 夕卡引物2(B3，5人3):TTGCG 环引物l(FLP , 5 -3 ) : TG TAAGCAAGTA ACGACAATCT CGCCGATGAC F2 ACTCACCAACATTG B2 AACGTGACTCCCTTAA 5 立ON|立.hBHZ的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第14部分:玉米59122品系SN/T 3767.14-2014 气去中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷l. 印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷开本880X12301/16 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元x 书号:155066 227468 SN/T 3767.14-2014
