1、人民共和入境检瞌检瘦行标准SN/3767.20-2014 出口食品中转基因成分环介等温扩增CLAMP)检测方?第20部分:71韬Bt-63晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 20: Rice Bt-63 2014田01-13发布2014-08-01实施.，筒里137，走一.6，.，咿-回田-蝇、白二. I .IA-. I J、陈1.1雪白磨吨同立在罪吗?怒骂宝安及1万中华人民共和国发布国家股量监督
2、拴验检技总局SN/T 3767.20一2014自U疫检检境1验人检出任境宁时责人辽的出国nu 3和头和为哼汕共分国民哄抢和人配MM共华f民中附阳认同唯不叫疫P陶叶检川山如局验布疫检虹坡。检垃民口金人扩件日创出辄轧文井中则建导胞中J刷川川、时阶则利会U川和协.，。除专员hv共时mM呆呆呆品协品时川川师眼咽成rEZ呵呵呵肌ZZ叫:ttrrru刮过出巳m山川问:mmmmU川mmnmmtt肌mU川川出注米米米米米豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜Ti的认位冲出用选米米米米米开米玉玉玉玉玉大大大大大水水水水水水水水小甜油WG件家单如阿通筛玉玉玉玉玉玉玉.分分分分A川A川八川分分分分分分分分分分分分分LS照
3、文国草切刀分分分分分分分分阶部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部HV为按本由起，斗T部部部部部部部部音01234567890123456789叫分分意分分创刊w123456789111111111122222222223部部注部部剖卧第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本材局SN/T 3767.20一2014验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和罔北京出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、忡皑农业工程学院、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:易敏英、凌莉、卓锦雪、蔡颖、文IJ静宇、谢力、陈颖、邵碧英、曹际娟、冯家望
4、、曾静、李晓虹、高苏娟、石磊、张隽、陈源树、李婷、关丽军、李志勇。Il 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第20部分:水稻Bt-63品系SN/T 3767.20-2014 SN/T 3767的本部分规定了稻谷和大米中转基因水稻Bt-63品系特异性的环介导等温扩增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于稻谷和大米本方法的定性检测低限为2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室GB/T 19495.2 转基因产GB/T 19495.3 转基因产SN/T 2584 水稻及其产品SN/T 3767.2-2014出选方法
5、3 防污染措施环介导等温扩增检测4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理(LAMP)检测方法第2部分:筛规定。根据转基因水稻Bt-63品系列、源基因和水稻边界序列设计特异性内引物和外引物各一对，特异性SN/T 3767.20-2014 目标序列和引物碱基序列参见附录A。号|物特异性识别目标序列上的六个独立区域.利用st酶启动循环链置换反应，在水稻Bt-63品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的
6、焦磷酸根离子与反应榕液中的Mg2结合，产生副产物(焦磷酸镇)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量均同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0
7、oC土0.5oC和80.0oC :f: 0.5 oC 0 6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100L1 000 I。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料i除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs 1容液:每种核背酸浓度10mmol/Lo 6.3.3 st DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/f.1 L 6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl ( pH值为
8、8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氯化押、20mmol/L硫酸镜、l%TritonX-100。6.3.5 硫酸读溶液:150 mmol/Lo 6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:SYBRGree口1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因水稻Bt-63品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2。外引物扩增片段长度:209 bp 外引物l(F3，5一3) : TCTTGCCCGGCG TCAA T 外引物2CB3 , 5 -3) : TTCGT AGCCCCACCACT AC 内引物1(FIP , 5
9、-3) : TTG ACTGGAGCG AGGCGA TGGGA T AA T ACCGCGCCACA T 内引物2(BIP，5一3): GACCGCTGTT ATGCGGCCATTCCTCT AGAGTCGACCTGC 6.4 检测步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有目标基因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板，浓度应略高于方法检测低限。2 SN/T 3767.20-2014 6.4.1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的
10、空白对照(以DNAr容解液代替DNA模板)。6.4 .2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;再则应重新进行DNA提取和纯化。内册、基|坷的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 水稻t-63品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA榕液完全加入反应液中，不要档附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止血色液?昆合进入反应被中。表17.1韬t-63晶系LAMP反应体系组分工作液浓度力H样:量/11L反应体系终浓度Thcmo
11、lPol缓冲液10 2.5 1 外侧l二游引物(F3)10 vmol/L 0.5 。.2vmol/L 外似IJ下游寻|物(巳3)10 f1 mol/L 0.5 0.2 f1 mol/L 内侧上游寻|物(FIP)0mol/L 1. 0 1. 6 f1 mol/L 内侧下游引物(BIP)40mol/L 1. 0 1.6mo1/L cI:-JTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mol/L 硫酸续150 mmol/L 6 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/L 0.32 U/L DNA模板100 ng/11L 2 8 ng/L 水补足至25.
12、06.4.4 LAMP反应参数63.0 oC :!:0.5 oC恒温扩增90min , 80.0 oC士0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。3 SN/T 3767.20-2014 6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应
13、管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因水稻Bt-63品系初筛阳性还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 一一按照SN/T2584进行实时荧光PCR检测;一一一可对外引物PCR8 结果表述8.1 8.2 4 SN/T 3767.20-2014 附录A(资料性附录)转基因水稻t-63品系基因序列A.1 转基因水稻t-63品系特异目标序列(来自Accessionno.HQ161 055.1 ) 1669 TCTTGCCCGGCG 1681 TCAATACGGG AT
14、AATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA CCCCCGAAC八TCGCCTCGCT17111 CCAGTCAATG ACCGCTGTIA. 1IGCexCATTGAT咄咄GKGAqAGACTGGTGATTTCM汇1801 GGGCATGCCTGCAGGTCGACTCAGAGGATCCCGGACGAGTGCTG仪:;GCAGAI八AGCAGT1861 AGTGGTGGGG CTACGAA A.2 寻|物础基序列及构成F3. TCTTGCCCGGCGTCAA T 83.TTCGTAGCCCCACCACTAC Flc 俨/ FIP: TTGACTGGAGCGAGGCGATG B1
15、c / / / / / f / / / / z二叫一F各一一。一叫GGATAATACCGCGCCAct: AT 82 8IP. G ACCGCTG TT A TGCGGCCA TT1-CCT巳TA:GAGTGGAGGfGC3 叮FON-ON.hh的HZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第20部分:水稻Bt-63品系SN/T 3767.20-2014 .x 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区主里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷头开本880X12301/16 印张0.75字数10千字2014年12月第一版2014年12月第一次印刷印数1-1300 定价16.00元兴书号:155066.2-27474 SN/T 3767.20一2014
